通道載玻片內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)方法介紹

 
本應(yīng)用簡報(bào)說明了如何在細(xì)胞培養(yǎng)微通道內(nèi)生長貼壁細(xì)胞。將描述細(xì)胞接種，培養(yǎng)基交換和光學(xué)性質(zhì)。另外，顯示了細(xì)胞培養(yǎng)通道和標(biāo)準(zhǔn)開放孔格式之間的主要差異。 為了顯示細(xì)胞接種和μ-Slide處理，使用μ-Slide VI 0.4進(jìn)行演示。像通常方法一樣制備細(xì)胞懸液（例如3×105細(xì)胞/ ml）并將30μl加到通道中。將移液管尖端放在通道的入口上，并如圖所示指向通道。快速分配并填充整個(gè)渠道。 細(xì)胞附著后，如上圖所示，將60μl無細(xì)胞培養(yǎng)基填充到每個(gè)通道中。注意避免氣泡。如果在細(xì)胞粘附后進(jìn)行填充步驟，則不會將細(xì)胞沖洗出通道。如果您想在細(xì)胞接種后立即填充通道，請小心移液。
  μ-Slide VI 0.4在顯微鏡觀察時(shí)已充滿細(xì)胞和培養(yǎng)基。 填充μ-Slide VI 0.4的Luer儲液孔。
 
2.培養(yǎng)基交換
a.連續(xù)介質(zhì)交換 - 推薦使用
對于連續(xù)介質(zhì)更換，首先從儲存器中移除舊介質(zhì)。然后，將適量的新鮮培養(yǎng)基加入一個(gè)儲液器中，同時(shí)從另一個(gè)儲液孔中吸出。小心使用細(xì)胞培養(yǎng)移液器。我們建議體積至少是通道容積的3倍。重新填充儲液器。
 
連續(xù)交換介質(zhì)體積為3倍的介質(zhì)。
 
b.完全的培養(yǎng)液交換 - 僅適用于昂貴的液體
 
如果僅僅更換通道內(nèi)液體，請先清空通道。然后，將移液管尖端放在通道入口上，并小心地將液體從通道中吸出。使用細(xì)胞培養(yǎng)移液器徹底清除所有液體。為了重新填充通道，將通道容量的新鮮介質(zhì)直接注入通道。避免產(chǎn)生氣泡。重新填充兩邊的蓄液孔。
 
完全清空通道可能導(dǎo)致重新填充后形成氣泡。
 
通道和儲存孔液體完全替換。
 
 
3.通道載玻片與多孔載玻片
在下面部分，我們將μ-Slide VI 0.4（細(xì)胞培養(yǎng)通道）的特性與μ-Slide 8孔（開放格式）進(jìn)行比較。 對于接種細(xì)胞，主要差異是結(jié)構(gòu)內(nèi)部液體的高度。兩個(gè)系統(tǒng)的小區(qū)域部分如下所示。μ-Slide VI 0.4通道內(nèi)部底部和頂部之間的距離為400μm。填充的μ-Slide 8孔載玻片沒有頂部結(jié)構(gòu)。在8孔載玻片里面，培養(yǎng)基約為0.3毫，通道載玻片比開放格式8孔載玻片薄7.5倍。
 
對于細(xì)胞接種，必須應(yīng)用不同的細(xì)胞密度以在表面上獲得相同量的細(xì)胞。在該示例中，目標(biāo)是接種25個(gè)細(xì)胞/單位面積。由于μ-Slide 8孔內(nèi)液體的高度是7.5倍，因此應(yīng)用的細(xì)胞濃度必須低于相同的因子。
 
 
基于不同高度的液體內(nèi)部μ-Slide VI 0.4和μ-Slide 8孔。在上面的例子中，相同的生長區(qū)域和細(xì)胞數(shù)量但不同的體積導(dǎo)致所需的細(xì)胞濃度不同。
 
 
為了獲得相當(dāng)程度的融合，我們建議使用3 ... 7 x 105細(xì)胞/ ml（μ-Slide VI 0.4）和4 ... 9 x 104細(xì)胞/ ml（μ-Slide 8孔）。這是兩個(gè)幾何形狀之間相同的~7.5倍。細(xì)胞粘附后，每單位面積的細(xì)胞數(shù)相同。
 
由于不同的高度，不同的細(xì)胞濃度產(chǎn)生相同等級的細(xì)胞聚合。
 
4.通道μ-Slide的優(yōu)點(diǎn)
與標(biāo)準(zhǔn)開孔格式相比，通道載玻片具有很強(qiáng)的優(yōu)勢。
 
a.相差顯微成像效果更好
通道幾何結(jié)構(gòu)很方便使用相差顯微鏡，因?yàn)闆]有凹液面的影響，整個(gè)生長區(qū)域可以用相差技術(shù)觀察。 與開放式多孔載玻片不同，通道載玻片不會干擾相差顯微鏡的光束路徑，從而獲得更好的相差效果。
 

開放式多孔培養(yǎng)板(圖a,圖b)：凹液面影響了了相差效果。只有中心部位能提供高質(zhì)量的對比度。
 
通道式載玻片(圖c,圖d)：在通道幾何結(jié)構(gòu)中，光束路徑始終對齊。整個(gè)視野都可以提供高質(zhì)量的相差顯微鏡成像。
 
 
b.細(xì)胞分布均勻
 
在通道中，因?yàn)檫吘壭��?yīng)小，貼壁細(xì)胞的同質(zhì)性要好得多。
 
下面的顯微圖像，相差（a）和熒光（b）模式中顯示了開放孔（1-3）中細(xì)胞分布的不均勻性和細(xì)胞培養(yǎng)通道（4-6）中的同質(zhì)性。
  1     開放式多孔載玻片，邊緣位置成像
2     開放式多孔載玻片，隨機(jī)位置成像
3   開放式多孔載玻片，中心部分
4     通道載玻片，邊緣位置成像
5     通道載玻片，隨機(jī)位置成像
6   通道載玻片，中心位置成像