ACE HILIC色譜柱方法開(kāi)發(fā)指南Ⅰ - HILIC的優(yōu)劣勢(shì)剖析

引言

親水作用色譜（HILIC）采用與反相液相色譜（RPLC）類(lèi)似的洗脫液，為親水性或極性到（至）極性很強(qiáng)的分析物提供了適宜的保留和分離替代方法（適宜的保留和分離提供了替代方法）。
RPLC的特征在于保留較少或無(wú)保留，所以這類(lèi)親水性分析物（log P 值約為零或更小的那類(lèi)分析物）的保留是一種挑戰(zhàn)（這些親水性的分析物（log P 值約為零或更小的那類(lèi)分析物）的保留對(duì)于RPLC是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)橛梅聪嗌�譜方法這些分析物只具有很少的保留或者沒(méi)有保留）。

ACE HILIC色譜柱為親水性分析物提供了RPLC的替代選擇，無(wú)需使用諸如離子對(duì)試劑等添加劑。
多年來(lái)，比較常見(jiàn)的是采用高有機(jī)物含量的洗脫劑與水性組分結(jié)合使用（采用高有機(jī)含量的洗脫劑與水性組分結(jié)合是常見(jiàn)的HILIC方法），但HILIC一詞最早是在20世紀(jì)90年代[1]首次被提出用來(lái)代表極性分析物保留和分離所用的富含有機(jī)溶劑的洗脫劑（描述富含有機(jī)溶劑的洗脫劑用來(lái)保留和分離極性分析物）。

作為一種技術(shù)，HILIC已經(jīng)應(yīng)用到了幾乎所有的色譜應(yīng)用領(lǐng)域，并且經(jīng)證明可有效用于臨床分析、食品和飲料應(yīng)用、以及制藥行業(yè)和蛋白質(zhì)組學(xué)，這些領(lǐng)域中，極性到（至）極性很強(qiáng)的分析物的保留和分離仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

 

色譜法所用HILIC的主要優(yōu)勢(shì)

HILIC可對(duì)極性到極性很強(qiáng)的分析物進(jìn)行（提供）保留

作為一般的實(shí)用經(jīng)驗(yàn)法則，如果RPLC模式下分析物在咖啡因之前洗脫（log P~零（約為0）），則可能更適合HILIC分離模式。
如果RPLC模式下分析物在咖啡因之后洗脫，則更適合RPLC。
圖1示出了（表示）一種含有草甘膦（log P = -2.39）、咖啡因（log P = -0.13）和阿米替林（log P = 4.90）的混合物的RPLC梯度色譜圖。

圖1的頂部顯示的是一個(gè)近似值，HILIC和RPLC模式可在log P尺度內(nèi)運(yùn)行和重疊（顯示在Log P尺度下HILIC和RPLC模式操作和重疊的一個(gè)近似位置）。

很明顯，極性很強(qiáng)的分析物草甘膦會(huì)在RPLC模式下的柱頭塌陷附近洗脫，并且（表明）它非常適合HILIC。

RPLC模式可保留咖啡因（咖啡因可以使用RPLC模式），但也可使用HILIC。RPLC與HILIC之間的重疊區(qū)域常常會(huì)引發(fā)討論，因?yàn)閮煞N模式都具有優(yōu)勢(shì)：選擇通常都是由應(yīng)用導(dǎo)向（已有應(yīng)用決定）。

阿米替林是最適合RPLC的疏水性分析物（疏水性分析物最適合用RPLC）。

如果分析物的log P特性未知，運(yùn)行在RPLC模式（如圖1所示）下的廣泛搜索梯度常�？梢詭椭�確定近似分析物的（的分析物）親水性/疏水性，同時(shí)可指示最適合的分離模式。

圖1
HILIC和RPLC操作范圍和重疊的實(shí)際演示
色譜柱：ACE 2 C18, 100 x 3.0 mm
流動(dòng)相：A = 10 mM 甲酸銨，pH 3.0 (aq) B = 10 mM 甲酸銨，pH 3.0 in MeCN:H2O (90:10 v/v)
梯度：5-100%B（10分鐘）
檢測(cè)：ELSD
流速：0.4 mL/min
溫度：30ºC
進(jìn)樣：10 μL
使用VWR-Hitachi進(jìn)行分析Chromaster（帶VWR ELSD90）

 

HILIC為RPLC提供了替代選擇

HILIC第二個(gè)優(yōu)勢(shì)特性在于：它通常能為RPLC提供互補(bǔ)或正交選擇，如圖2中所演示。

HILIC模式（圖2b）下，六種極性分析物的混合物的洗脫圖（洗脫情況）與采用RPLC分析的相同混合物正好相反，證明HILIC具有正交選擇性。

 

 

圖2
RP與HILIC之間的正交選擇性
（a）柱：ACE 5 C18, 150 x 4.6 mm
流動(dòng)相：0.1%醋酸（溶于乙腈/水中）（5:95 v/v）
（b）柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流動(dòng)相：0.1%醋酸（溶于乙腈/水中）（95:5 v/v）
流速：1 mL/min
溫度：22 °C
檢測(cè)：UV, 254 nm
進(jìn)樣：5 μL
樣品：
1) 胞嘧啶
2) 次黃嘌呤
3) 胸腺嘧啶
4) 可可堿
5) 茶堿
6) 咖啡因

選擇性是色譜分析中分析物析出（分辨率）的關(guān)鍵，因此可利用HILIC最大化極性到極性很強(qiáng)的分析物的選擇性（對(duì)于極性到強(qiáng)極性化合物，可利用HILIC最大化選擇性）。

在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，利用選擇性是了解分析物保留行為的第一步，同時(shí)也是增加觀(guān)察到樣本（樣品）內(nèi)所有種類(lèi)可能性的一種有效工具。

不同且復(fù)雜的HILIC多模式保留機(jī)制為RPLC提供了一種理想的互補(bǔ)選擇性分離模式。

 

HILIC使用高有機(jī)物含量的洗脫劑

第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)源于HILIC模式下使用的高有機(jī)物含量的洗脫劑。

結(jié)果表明：與RPLC相比，其快速擴(kuò)散系數(shù)可達(dá)RPLC的兩倍，從而可強(qiáng)化傳質(zhì)和減輕C項(xiàng)對(duì)范第姆特方程（減小范特姆第方程C相） [2]的作用。

但是，HILIC中的流動(dòng)相必須包含至少3%的水性物質(zhì)，以（因需）在固定相粒子周?chē)�形成吸附水層以便分散開(kāi)（分配）。非質(zhì)子有機(jī)溶劑乙腈通常用作HILIC中較弱的溶劑。

此外，HILIC洗脫劑對(duì)MS檢測(cè)[3]也有幫助。

有機(jī)溶劑含量非常高，可實(shí)現(xiàn)理想的低表面張力（高的有機(jī)溶劑含量可提供一個(gè)理想的低表面張力），并為MS源提供高揮發(fā)性的液體流，從而改善去溶劑化和離子形成的條件，因此增強(qiáng)
了信號(hào)響應(yīng)。

 

HILIC分離通常可提供較低的背壓

通常，HILIC模式下的色譜柱（和體系（系統(tǒng)））背壓比水-有機(jī)的RPLC洗脫劑更低（尤其是當(dāng)主要使用最常用的乙腈時(shí)）。
這為色譜工作人員提供了一個(gè)選擇：在流速更高、甚至多組色譜柱結(jié)合（串聯(lián)使用）的情況下，都可以使用更小、更高效的粒子，增加了平板計(jì)數(shù)（理論塔板數(shù)）或峰容量，同時(shí)背壓[4,5]也適度（在背壓合適的情況下，增加了平板計(jì)數(shù)（理論塔板數(shù)）或峰容量 [4,5]）。

 

色譜法所用HILIC的主要劣勢(shì)

HILIC法的穩(wěn)定性

這是一個(gè)經(jīng)常討論和報(bào)道的HILIC相關(guān)（與HILIC相關(guān)的）主題。

許多問(wèn)題可以通過(guò)使用前足夠平衡的HILIC色譜柱的方式解決。

如果HILIC法包含一個(gè)梯度（梯度洗脫），那么進(jìn)樣之間也需要足夠的平衡。

 

樣本溶解性

由于其本身的性質(zhì)，極性到極性很強(qiáng)的分析物很難溶解在有機(jī)物含量豐富的溶劑中并持續(xù)保持溶解狀態(tài)（在含有大量有機(jī)物的溶液中很難溶解以及保持溶解狀態(tài)）。