ACE HILIC色譜柱方法開發(fā)指南Ⅱ - HILIC的分離機(jī)制

HILIC分離機(jī)制

HILIC是一種復(fù)雜的分離技術(shù)，通過多種相互作用模式來實(shí)現(xiàn)保留。

這些相互作用的權(quán)重（中哪種是主要作用）是基于固定相、流動(dòng)相和分析物的理化特性。

為了得到可靠和穩(wěn)健的HILIC方法，了解潛在的不同相互作用（了解可能存在的不同相互作用）是很有幫助的。

這樣可以為待進(jìn)行的方法開發(fā)合理選擇色譜柱和條件。（這樣可以為方法開發(fā)的色譜柱和條件做出合理的選擇）
HILIC中的流動(dòng)相通常包含大量的乙腈（>70%）以及至少3%的水。

水性組分使得極性固定相周圍存在親水環(huán)境，并且形成吸附水層以便分析物分散（分配）。

主要的HILIC保留機(jī)制包括：
分析物分散（分配）到吸附水層，各種極性相互作用和靜電（即離子交換式）相互作用（參見圖3）。

如果將極性分析物通入（極性分析物進(jìn)入）HILIC環(huán)境中，則可使用這些保留機(jī)制中的任意一種（則物質(zhì)的保留可能是任何一種機(jī)制作用，也可能是所有機(jī)制同時(shí)作用）。

圖3
潛在HILIC保留機(jī)制圖示

極性分析物通常包含能夠與其它極性基團(tuán)相互作用的各種基團(tuán)，如：固定相上的基團(tuán)。極性相互作用包括氫鍵和偶極-偶極與其它基團(tuán)的相互作用。帶

電分析物也可以進(jìn)行靜電或離子交換式相互作用，其中分析物可以被固定相吸引或排斥。

例如，一個(gè)帶負(fù)電的或酸性的分析物會(huì)被帶負(fù)電的（即酸性的）固定相排斥。

但是，帶正電的或堿性的分析物可被帶負(fù)電的（酸性的）固定相保留，反之亦然。

 

ACE HILIC色譜柱固定相：

過去，許多HILIC固定相都采用非鍵合硅膠。

這些酸性相提供了必要的相（固定相必要的）極性，以在（使其能）HILIC模式中與高有機(jī)物含量洗脫劑很好地相互作用。

非鍵合硅膠相很有（好）用，所以仍在廣泛使用。

最近，在市場(chǎng)上已經(jīng)可以買到專門用于HILIC環(huán)境的各種鍵合相（固定相）。

這些新的極性鍵合相根據(jù)相（固定相的）特性可分為很多種，包括酸性的、堿性的、中性的和新型的化學(xué)相。

ACE HILIC組合目前包括酸性的、中性的和堿性的固定相。

這些相已被證實(shí)可相互提供不同的選擇性。
這些（三款）ACE相（固定相）彼此提供了替代選擇性，可參見圖4.九種組分混合物中的中性和帶電分析物，在相同條件下，對(duì)三種不同的ACE HILIC相（在三款不同固定相的ACE HILIC色譜柱上）顯現(xiàn)出不同的保留和洗脫順序。

這清楚地表明：HILIC模式下各ACE HILIC固定相之間存在選擇性差異，使得這三種色譜柱成為HILIC方法開發(fā)的理想選擇。

圖4
ACE HILIC固定相范圍內(nèi)洗脫順序的對(duì)比
色譜柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流動(dòng)相：10 mM甲酸銨，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
溫度：25 °C
檢測(cè)：UV, 254 nm
樣品：
1) 對(duì)氨基苯甲酸
2) 4-羥基苯甲酸
3) 煙酰胺
4) 醋丁洛爾
5) 腺嘌呤
6) 扁桃酸
7) 酪胺
8) 阿替洛爾
9) 2’-脫氧鳥苷

 

ACE HILIC-A相

ACE HILIC-A相能形成負(fù)電荷，并顯示出高（強(qiáng)）陽離子交換能力。

帶電的堿基（堿性物質(zhì)）對(duì)ACE HILIC-A相進(jìn)行（產(chǎn)生）靜電吸引，而帶電的酸性物質(zhì)則被排斥。
ACE HILIC-A相的帶電程度取決于流動(dòng)相的pH值。

ACE HILIC范圍的推薦pH限值為pH2.0到pH7.0。

通過增大pH值，固定相上的負(fù)電荷將變得更明顯，從而保留更多的陽離子分析物。

 

ACE HILIC-N相

中性ACE HILIC-N相對(duì)陰陽離子都顯示出較低的離子交換能力。

ACE HILIC-N相的保留機(jī)制包括極性相互作用、吸附和一定程度的分散（分配能力）。

 

ACE HILIC-B相

ACE HILIC-B相具有合理的陰離子交換能力，從而可保留酸性分析物，同時(shí)堿性分析物將被排斥。

與ACE HILIC-A相似，pH值可影響固定相的電荷，因此可減弱或增強(qiáng)該相的正特性（該相的正電荷特性）。