ACE HILIC色譜柱方法開發(fā)指南Ⅲ - HILIC法色譜條件

HILIC流動(dòng)相

HILIC模式中用作流動(dòng)相的溶劑類似于RPLC模式下所用的溶劑。

流動(dòng)相條件是各種HILIC保留機(jī)制的關(guān)鍵因素。

通過(guò)改變洗脫液中有機(jī)組分和水組分的比例，可以改變分析的保留率。

在HILIC模式下，保留因子建議保持在1.5-10之間。

 

有機(jī)改性劑

HILIC中最常用的有機(jī)改性劑是非質(zhì)子溶劑乙腈。

乙腈作為較弱的洗脫溶劑與水結(jié)合使用（見圖5）。

與RPLC不同，增加流動(dòng)相中的有機(jī)物含量百分比，可增大分析物的保留率。

乙腈具有粘度（粘度低）和紫外線切斷（截止波長(zhǎng)）較低等優(yōu)點(diǎn)。

由于能夠干擾固定相周圍的水層，所以散裝（主體）溶劑中通常要避免甲醇等質(zhì)子溶劑。

這些溶劑可以形成氫鍵，從而破壞分析物分散（分配能力）。
但是，也存在極性溶劑（如甲醇和2-異丙醇（IPA））與水性部分結(jié)合使用以影響分離選擇性的各種情況。

如果所有其它參數(shù)不能實(shí)現(xiàn)足夠的分離[6]，這通常作為最后的方法來(lái)使用。

 

洗脫劑pH值

洗脫劑的pH值對(duì)于方法開發(fā)來(lái)說(shuō)是一個(gè)有用的參數(shù)。

如果pH值高于或低于可電離物質(zhì)的pKa，則分析物的電離狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，反過(guò)來(lái)會(huì)影響它的親水性。

因此，這會(huì)影響（影響可電離分析物）與固定相的潛在相互作用，并且還會(huì)影響保留。

此外，pH值也會(huì)影響固定相表面的極性，進(jìn)而影響到保留機(jī)制。
了解分析物的pKa非常有助于pH選擇。若可能的話，建議與pKa相差2個(gè)pH單位，以達(dá)到特定的方法穩(wěn)定性。對(duì)于酸性物質(zhì)，低于pKa將使分析物主要以非電離狀態(tài)存在。

在酸性分析物pKa的2個(gè)pH單位以上將使大部分分析物電離。對(duì)于堿性物質(zhì)，正好相反。
為了進(jìn)行方法開發(fā)，建議對(duì)（在）三種不同pH值條件下各種（用三款）ACE HILIC色譜柱的（對(duì)）混合分析物進(jìn)行評(píng)估：
pH 3.0、4.7和6.0。這種方法探索了不同洗脫劑pH值條件下使用不同固定相時(shí)的選擇性差異，而且經(jīng)證明對(duì)HILIC方法開發(fā)是有效的。

例如，ACE HILIC-A相中，在pH為3.0、4.7和6.0的等度條件下，分析了包含酸性物質(zhì)和中性物質(zhì)的混合物（見圖6）。所有其它條件都相同。

保留和洗脫順序的差異（即選擇性差異）可清楚地看出，這一單個(gè)HILIC相的pH值不同。

 

圖6
ACE HILIC-A相中，不同流動(dòng)相pH值下六種極性分析物的分析中性物-綠色酸-紅色
色譜柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流動(dòng)相：10 mM甲酸銨（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
檢測(cè)：UV, 254 nm
溫度：25 °C
進(jìn)樣：5 μL
樣本：
1) 4-氨基苯甲酸
2) 4-羥基苯甲酸
3) 煙酰胺
4) 扁桃酸
5) 腺嘌呤
6) 2’-脫氧鳥苷

 

緩沖液濃度

HILIC中可使用各種緩沖鹽，但緩沖鹽必須可溶解于高有機(jī)物含量的（含有高比例有機(jī)物的）洗脫劑中。

這就排除了像磷酸鹽這樣的無(wú)機(jī)緩沖鹽。

甲酸銨緩沖鹽比較適宜，因?yàn)樗鼈冊(cè)诘蚿H范圍內(nèi)具有緩沖能力，并在高乙腈含量的洗脫劑中具有良好的溶解性。

HILIC的緩沖液濃度范圍通常為2-18mM。
緩沖液濃度對(duì)保留率和選擇性的影響取決于分析物和固定相的特性。

例如，圖7顯示了pH為3.0時(shí)，通過(guò)ACE HILIC-A固定相，甲酸銨緩沖液的濃度對(duì)三（三種）組分（極性的酸性、堿性和中性分析物）混合物分析物保留率（保留）的影響。

洗脫劑濃度低（洗脫劑的低pH）意味著：酸吡哆醛（峰1）以離子抑制或中性的形式存在。胞啶（峰2）是一種極性的中性分析物。

普魯卡因胺（峰3）是一種帶電的極性堿。在ACE HILIC-A相的這些條件下，極性堿的保留率顯著下降，而（隨著）緩沖液濃度增大（隨著緩沖液濃度增大，極性堿的保留率顯著下降）。

極性堿很可能主要是通過(guò)與帶電酸性固定相進(jìn)行離子交換的方式來(lái)保留。

緩沖強(qiáng)度的增加會(huì)使（與）堿性分析物形成競(jìng)爭(zhēng)，并且保留率隨后會(huì)因離子交換機(jī)制的耗盡而減小。

 

圖7
緩沖液強(qiáng)度對(duì)分析物保留率的影響
色譜柱：ACE 5 HILIC-A,150 x 4.6 mm
流動(dòng)相：甲酸銨，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
檢測(cè)：UV, 254 nm
溫度：25 °C
進(jìn)樣：5 μL
樣本：
1) 吡哆醛
2) 胞啶
3) 普魯卡因胺

 

樣品稀釋液

HILIC模式下，由于分析物溶解性以及稀釋液與HILIC洗脫劑不匹配等問(wèn)題，通常較難選擇合適的樣本（樣品）稀釋液。

選擇優(yōu)化不足的稀釋液會(huì)大大降低色譜性能和峰形。

通常，樣本稀釋液對(duì)各種分析物的影響不一樣，并且這種行為因固定相的選擇和洗脫劑的條件而存在差異。

因此，對(duì)樣本稀釋液的優(yōu)化往往是針對(duì)特定應(yīng)用的研究。
一般來(lái)說(shuō)，建議增量為20%，緩沖比介于20%到80%之間（建議20%的乙腈增量讓其處于緩沖比20%-80%之間來(lái)探索樣品稀釋方法）。

例如，圖8（第16頁(yè)）顯示了pH為3.0時(shí)，三個(gè)ACE HILIC相中的每一個(gè)相（固定相）上酸性、堿性和中性分析物的峰形，其中研究了樣本（在這三個(gè)固定相上的研究樣品）稀釋液乙腈（MeCN）的百分比。
通常，次黃嘌呤（極性中性）的峰形會(huì)隨著所有ACE HILIC相有機(jī)濃度的增大而改善。

然而，分析物未能在100%的乙腈中溶解。

這種分析物最有效的樣本（樣品）稀釋液是60-80%的乙腈。

在樣本稀釋液中乙腈濃度較低的情況下，酪胺（堿性分析物）顯示了ACE HILIC-B相和ACE HILIC-N相的分裂峰。
然而，這種效果對(duì)ACE HILIC-A并沒(méi)有那么明顯，峰形仍然很差。

對(duì)于60%以上的乙腈，所有ACE HILIC相的峰形都有改善。

扁桃酸的峰形通常不受ACE HILIC-B和ACE HILIC-N的樣本（品）稀釋液的影響。但是，對(duì)于ACE HILIC-A，有機(jī)濃度較低時(shí)峰形較差。
根據(jù)這個(gè)數(shù)據(jù)集，對(duì)于該HILIC應(yīng)用，建議使用60-80%的乙腈樣本（樣品）稀釋液。

對(duì)于各HILIC應(yīng)用，建議進(jìn)行此類系統(tǒng)研究。

如果可能的話，最好采用較高濃度的分析物和較小的進(jìn)樣量。

這樣可盡量減少（盡可能減少）對(duì)吸附水層的破壞。

樣本（樣品）溶解性與樣本（樣品）濃度之間的平衡（權(quán)衡）始終具有挑戰(zhàn)，尤其是對(duì)于HILIC而言。

 

圖8
（a）ACE HILIC-A相（b）ACE HILIC-B相和（c）ACE HILIC-N相中樣本溶液對(duì)次黃嘌呤、酪胺和扁桃酸的色譜峰形的影響。
色譜柱：150 x 4.6 mm, 5μm

流動(dòng)相：甲酸銨，pH4.7，（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）

流速：1.5mL/min

溫度：25 °C

檢測(cè)：UV, 254 nm

進(jìn)樣：5 μL

 

溫度

溫度是方法開發(fā)中一個(gè)很有用的參數(shù)。

溫度對(duì)保留的影響程度取決于固定相和分析物二者。例如，分析物的pKa可能隨著溫度的變化而變化，從而影響電離和保留的程度。
據(jù)記載，對(duì)于HILIC，隨著溫度的升高，保留率有可能同時(shí)增加和減少，如圖9中所示，分離出極性的酸性、堿性和中性分析物（極性的酸性、堿性和中性分析物的分離）。
在HILIC方法開發(fā)中，建議不要將溫度作為優(yōu)化選擇性和分離的主要參數(shù)。

與色譜柱化學(xué)特性、有機(jī)物含量百分比或洗脫劑pH值等參數(shù)相比，在HILIC模式下它能改變保留率（保留的作用微弱）。

 

圖9
下列相中溫度對(duì)酸性、堿性和中性分析物混合物的分析物保
留率的影響:
(a) ACE 5 HILIC-A
(b) ACE 5 HILIC-N
(c) ACE 5 HILIC-B
色譜柱：150 x 4.6 mm
流動(dòng)相：10 mM甲酸銨，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
檢測(cè)：UV, 230 nm
進(jìn)樣：5 μL
樣本：
1) 4-羥基苯甲酸
2) 沙丁胺醇
3) 2’-脫氧鳥苷
4) 色氨酸