ACE HILIC色譜柱方法開發(fā)指南Ⅳ - HILIC儀器兼容性
HILIC是一種能很好兼容眾多主流檢測器的技術(shù)。因此，檢測的（檢測器的）選擇受檢測器可用性、所需的檢測限制和分析物的理化特性（即：具有發(fā)色團(tuán)或電荷）等綜合因素的影響。
UV-Vis檢測器
UV-Vis檢測器是分析試驗(yàn)室中最常見的檢測器之一。
根據(jù)儀器的不同，一次可記錄多個(gè)波長，以優(yōu)化分析物覆蓋范圍。
有時(shí)，混合物中的分析物可通過參考紫外光譜庫來快速識別。
圖10中的例子示出了五種β受體阻滯劑的分離，這些阻滯劑可通過他們不同的圖譜清楚識別（識別清楚）。
圖10
五種β受體阻滯劑的色譜圖和紫外光譜
色譜柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流動相：10 mM甲酸銨pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
溫度：25 °C
檢測：UV, 214 nm
樣本：
1) 普萘洛爾
2) 醋丁洛爾
3) 索他洛爾
4) 沙丁胺醇
5) 阿替洛爾
折射率檢測器
示差折光測器（RID）測量當(dāng)通過檢測器時(shí)分析物峰相對參考溶劑（即流動相）的折射率。如果這二者之間存在差別，色譜圖中可觀察到峰。
RID對缺乏活性發(fā)色團(tuán)的分析物很有用，尤其常用于糖分分析。
RID存在幾個(gè)方面的劣勢。這些劣勢包括靈敏度受限和沒有峰相關(guān)的信息（峰的身份通常需要單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)來驗(yàn)證）。
此外，RID只能用于等度條件，因?yàn)橄疵搫ㄏ疵搫┙M成變化）會改變折射率響應(yīng)。
作為物理測量，折射率也很受溫度的影響，也就是說，基線噪聲和再現(xiàn)（重現(xiàn)）性會發(fā)生變化。
蒸發(fā)光散射檢測器
蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）通過如下方式工作：從LC上噴射輸出洗脫液與惰性氣體（通常為氮?dú)猓�，以形成液滴在加熱室�?nèi)去溶劑化。
去溶劑化后的分析物被分散的光源擊中，然后進(jìn)行檢測（噴射出惰性氣體來霧化從LC中輸出的洗脫液，形成液滴后在加熱管中蒸發(fā)，去溶劑的分析物被分散的光源擊中然后進(jìn)行檢測）。
探測器（ELSD）需要揮發(fā)性洗脫劑，以使HILIC非常適合（HILIC方法就非常適合這款檢測器）。ELSD是RID有效的替代選擇，因?yàn)樗浅＿m合非（無）發(fā)色團(tuán)分析物，靈敏度更高，并且適用于梯度色譜法。
但是，ELSD不提供光譜信息，因此在沒有標(biāo)準(zhǔn)的情況下，較難識別峰值（峰的識別很困難）。
對于HILIC分離（分析物），ELSD對發(fā)色團(tuán)有限（有限發(fā)色團(tuán)）的極性分析物更有利，例如甲基丙二酸（MMA）和琥珀酸（圖11）。
MMA用作維生素B12缺乏癥的生物標(biāo)志，但琥珀酸與MMA等壓（元素相同），因此必須徹底解決以防止假陽性結(jié)果。
采用ELSD的HILIC法，其MMA量化比紫外線檢測法更好。
圖11
甲基丙二酸和琥珀酸的色譜圖
色譜柱：ACE 5 HILIC-B,
150 x 4.6 mm
流動相：10 mM
甲酸銨pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
溫度：25 °C
檢測：ELSD
樣本：
1) 琥珀酸
2) MMA
質(zhì)譜儀
質(zhì)譜儀（MS）是LC分離中信息最豐富的檢測技術(shù)。
LC的洗脫劑流通常使用惰性氣體（如氮?dú)猓┤ト軇┗↙C流出的洗脫液在加熱管中被惰性氣體去溶劑化），并在檢測前電離。
可使用不同的質(zhì)譜分析儀，如：四極質(zhì)譜儀、飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、離子阱質(zhì)譜儀等。有機(jī)物含量較高的HILIC洗脫劑特別適合MS檢測。
有多個(gè)電離源可用，根據(jù)具體應(yīng)用進(jìn)行選擇。
噴霧電離質(zhì)譜（ESI）很常用，但也使用電暈放電和光電離源。MS具有高度專一性，因?yàn)榭衫眠x擇性離子檢測（SIM）進(jìn)行跟蹤（因?yàn)榭梢允褂眠x擇離子性監(jiān)測來跟蹤單個(gè)物質(zhì)的荷質(zhì)比（m/z），得到更好的選擇性），提高靈敏度。MS還可以在不同質(zhì)量范圍內(nèi)執(zhí)行掃描，這對未知的樣本（樣品）很有幫助。
但是，MS掃描通常靈敏度小得多。（具有更小的靈敏度。）
MS可用于檢測發(fā)色團(tuán)較弱或者沒有發(fā)色團(tuán)的分析物。
作為一種識別工具，MS對HILIC應(yīng)用也很有幫助，這種應(yīng)用中分析物具有相似的紫外光譜特性，但質(zhì)量不同（在HILIC應(yīng)用中，當(dāng)分析物具有相似的紫外光譜特性，但質(zhì)量不同，MS是很有用的識別工具）。
核酸堿基和核苷就是一個(gè)很好的HILIC例子。極性分析物腺嘌呤、腺苷和2’-脫氧腺苷的紫外光譜非常相似（圖12）。
圖12
腺嘌呤、腺苷和2’-脫氧腺苷的紫外光譜對比
藍(lán)色軌跡：腺嘌呤
紅色軌跡：腺苷
綠色軌跡：2’-脫氧腺苷
色譜柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流動相：10 mM甲酸銨，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
溫度：25 °C
檢測：UV
進(jìn)樣量：2 μL
MS可利用這些分析物不同的質(zhì)荷比進(jìn)行檢測和識別峰（圖13）。SIM用于提高靈敏度。
圖13
利用UV和MS聯(lián)合檢測法分析ACE HILIC-N的腺嘌呤和核苷
（a）下列物質(zhì)的紫外光色譜圖：
1) 2’-脫氧腺苷（m/z 252.4）
2) 腺嘌呤（m/z 136.1）
3) 腺苷（m/z 268.3）
(b) 通過MS SIM確認(rèn)峰
色譜柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流動相：10 mM甲酸銨，pH4.7（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）
流速：1.5 mL/min
溫度：25 °C
檢測：UV，254nm和MS
