Nucleic Acids Research：脂肪生成的表觀調(diào)控機制

肥胖和2型糖尿病的全球發(fā)病率在過去的30年中顯著增加，已嚴重危害人們的生命健康。脂肪組織被認為與該類疾病相關，因此操縱脂肪細胞的分化和成熟有望用于臨床治療。大量研究已闡明轉錄和表觀遺傳（DNA和組蛋白修飾）在脂肪發(fā)生過程中的重要作用，但是對于轉錄后調(diào)控如何影響脂肪生成，尚不清楚。

近日，華中農(nóng)業(yè)大學的研究人員在這一領域取得了新進展。華中農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院的博士研究生宋彤星和楊陽為并列第一作者，彭健和蔣思文教授為共同通訊作者。他們在《Nucleic Acids Research》上發(fā)表了題為“Zfp217 mediates m6A mRNA methylation to orchestrate transcriptional and posttranscriptional regulation to promote adipogenic differentiation”的文章，首次發(fā)現(xiàn)了ZFP217直接激活m6A去甲基化酶FTO的表達，并結合m6A閱讀蛋白YTHDF2，促進FTO對m6A mRNA的結合，從而促進脂肪細胞的分化。

鋅指蛋白217（Zfp217）是眾所周知的致癌蛋白，在多種癌癥中上調(diào)，對胚胎干細胞的分化至關重要。值得注意的是，Zfp217將基因轉錄與新生RNA上的m6A修飾緊密關聯(lián)，表明Zfp217在協(xié)調(diào)表觀遺傳和表觀轉錄組網(wǎng)絡中起關鍵作用。于是，研究人員猜測Zfp217可能通過調(diào)節(jié)m6A修飾而加速脂肪生成。

Zfp217抑制導致m6A修飾的增加

為了探索Zfp217在成脂分化中的作用，研究人員首先利用siRNA開展了功能缺失實驗。Zfp217的敲低明顯阻斷了脂肪生成，表現(xiàn)為油紅O染色水平下降，以及關鍵成脂基因PPARγ、aP2、LPL和脂聯(lián)素的表達水平降低。此外，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)完全敲除Zfp217基因后，3T3L1細胞中的脂肪生成完全被破壞。此外，他們還委托賽業(yè)生物（Cyagen）制備了Zfp217敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)Zfp217+/-小鼠胚胎成纖維細胞的脂肪生成減少。這些結果表明Zfp217對成脂分化有著重要的影響。

為了篩查Zfp217在3T3L1細胞中的功能，研究人員通過斑點印跡和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測了mRNA中的m6A修飾。與對照組相比，利用siRNA和CRISPR-Cas9系統(tǒng)處理后，3T3L1細胞中的m6A水平總體上增加（圖1）。與野生型細胞相比，Zfp217+/-小鼠胚胎成纖維細胞的m6A修飾也明顯增加。這些結果表明Zfp217對細胞m6A RNA甲基化至關重要。

圖1. Zfp217抑制導致3T3L1細胞中的m6A修飾增加

Zfp217直接激活FTO的轉錄

盡管Zfp217的失活影響了m6A修飾，但Zfp217本身并不是甲基轉移酶或去甲基化酶，那么Zfp217如何抑制m6A mRNA甲基化？于是，研究人員檢測了與m6A甲基化相關的關鍵蛋白的表達。有意思的是，Zfp217被敲低后，甲基轉移酶METTL3的表達增高，而去甲基化酶FTO的表達降低。進一步的研究表明，F(xiàn)TO的mRNA水平受到Zfp217過表達或敲低的調(diào)控。于是，他們想驗證Zfp217是否作為轉錄因子調(diào)控FTO的表達。

研究人員利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)來驗證Zfp217增強了FTO的啟動子活性，而FTO啟動子上結合序列的缺失抑制了其活性，說明Zfp217對FTO的直接調(diào)控（圖2）。同時，F(xiàn)TO拯救了因缺乏Zfp217而造成的脂肪生成受阻，并增加了PPARγ、aP2、LPL和脂聯(lián)素的表達。這些結果表明，Zfp217作為轉錄因子與FTO基因的啟動子結合，以增強脂肪生成。

圖2. Zfp217激活了FTO的轉錄

Zfp217與YTHDF2發(fā)生相互作用

之前的報道稱，Zfp217通過與胚胎發(fā)育和腫瘤中的其他蛋白質(zhì)相互作用而發(fā)揮其功能。為了進一步探索Zfp217促進脂肪生成的分子機制，研究人員又開展了免疫沉淀（Co-IP）實驗。他們在3T3L1細胞和HEK293T細胞中都發(fā)現(xiàn)了Zfp217和YTHDF2之間的特異性相互作用。

為了確認亞細胞相互作用，他們分離出細胞核和細胞質(zhì)組分來測定Zfp217和YTHDF2表達。他們發(fā)現(xiàn)，這兩種蛋白質(zhì)都分布在整個細胞中，不過Zfp217在細胞質(zhì)中的表達比細胞核更多。此外，共聚焦顯微鏡分析也觀察到兩種蛋白質(zhì)同時位于細胞核和細胞質(zhì)中，表明YTHDF2可能在Zfp217依賴的脂肪生成中發(fā)揮特定功能。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF2在熱應激下可通過抑制FTO活性來維持m6A的水平。于是，研究人員進一步分析了YTHDF2和Zfp217與FTO之間的相互作用。正如預期，F(xiàn)TO和Zfp217的過表達都顯示出較低的m6A水平，且YTHDF2阻斷了FTO的去甲基化酶活性，而Zfp217作為調(diào)控因子，讓平衡傾向于去甲基化（圖3）。
 

圖3. Zfp217影響了YTHDF2和FTO之間的競爭

此外，他們通過m6A RNA pull-down實驗證實了FTO和YTHDF2在靶向m6A ssRNA上的直接競爭關系。顯然，不與RNA結合的Zfp217干擾YTHDF2的位置，讓FTO與RNA結合。后續(xù)的實驗也證明，Zfp217與YTHDF2發(fā)生相互作用，以維持FTO的m6A去甲基化活性。

總的來說，該研究證明ZFP217在轉錄（激活FTO）和轉錄后（影響mRNA m6A修飾）水平參與脂肪生成的重要作用，并發(fā)現(xiàn)創(chuàng)造性的提出了ZFP217影響m6A閱讀蛋白YTHDF2和擦除器FTO競爭性結合靶mRNA的作用模型，為深入了解m6A的動態(tài)調(diào)控過程提出了新的思路。

圖4. Zfp217在脂肪生成中調(diào)控m6A修飾的示意圖

這是國際上首次報道RNA表觀修飾調(diào)控脂肪細胞生成的分子機制，是對脂肪細胞生成調(diào)控機制的全新認識，對拓展相關研究領域具有重要意義。