數(shù)字PCR之Evagreen染料法

Evagreen染料法數(shù)字PCR

EvaGreen®是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。作為新一代的綠色熒光核酸染料EvaGreen®，具有如下三個(gè)優(yōu)勢(shì)：

1.對(duì)PCR 的抑制小，因此在實(shí)驗(yàn)中EvaGreen®可使用快速PCR 溫度循環(huán)，同時(shí)可以使用較高濃度，提高亮度的同時(shí)也消除了“染料重新分布”；

2.穩(wěn)定性極強(qiáng)，在儲(chǔ)存、操作和PCR過(guò)程中不會(huì)被破壞，可以反復(fù)凍融；

3.降低了細(xì)胞膜透性，更加安全。

染料法dPCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系含有一對(duì)用于擴(kuò)增目的序列的特異區(qū)段的PCR引物和用于擴(kuò)增產(chǎn)物使用的EvaGreen®染料。

EvaGreen®實(shí)驗(yàn)的步驟如下

1.引物和擴(kuò)增子設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)的原則在qPCR和digital PCR中是一樣的。具體的設(shè)計(jì)原則可以參照前面發(fā)表的引物探針設(shè)計(jì)原則。

2.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

對(duì)于任何數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備：

數(shù)字PCR儀及專用耗材

PCR mix包含酶，dNTPs，buffer，Mg+

Evagreen

dH2O

普通PCR實(shí)驗(yàn)用品：tube chip 振蕩器 離心機(jī)等。

3.反應(yīng)體系

按如下反應(yīng)體系配置MIX：

4.反應(yīng)條件

*：根據(jù)實(shí)驗(yàn)引物的Tm值來(lái)決定

5.數(shù)據(jù)采集

根據(jù)所使用的系統(tǒng)，數(shù)據(jù)采集將采用芯片成像的形式(Naica™系統(tǒng)、QuantStudio™3D數(shù)字PCR系統(tǒng)、CONSTELLATION®數(shù)字PCR系統(tǒng)……)，或者類似于流式細(xì)胞術(shù)(QX200™液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)、Raindrop™數(shù)字PCR系統(tǒng))，逐個(gè)讀取分區(qū)。請(qǐng)按照制造商的說(shuō)明執(zhí)行此步驟。

6.數(shù)據(jù)分析

在EvaGreen digital PCR實(shí)驗(yàn)中，只有一個(gè)熒光通道需要檢查，因此數(shù)據(jù)將被表示為一維點(diǎn)圖。其中每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)分區(qū)，y軸表示藍(lán)色檢測(cè)通道中各分區(qū)的熒光強(qiáng)度，x軸表示分析軟件分配給各分區(qū)的指標(biāo)編號(hào)。

6.1數(shù)據(jù)質(zhì)控

根據(jù)數(shù)據(jù)采集的類型，數(shù)據(jù)分析軟件可以提供不同的質(zhì)量控制。應(yīng)當(dāng)仔細(xì)考慮兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)：

NTC：NTC只用陰性微滴

總微滴數(shù)：大量的可分析分區(qū)將減少與測(cè)量濃度相關(guān)的不確定性

在Naica™系統(tǒng)上，還可以可視化生成的分區(qū):

6.2閾值設(shè)置

通常，閾值是由分析軟件自動(dòng)設(shè)置，閾值以上的分區(qū)為正，閾值以下的分區(qū)為負(fù)。因此，設(shè)置閾值是數(shù)字PCR對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行處理的一個(gè)強(qiáng)制性步驟。由于閾值設(shè)置是自動(dòng)計(jì)算，我們建議您查看點(diǎn)一維圖。但是，下面兩種情況需要手動(dòng)設(shè)置閾值：

●當(dāng)有非常少的正分區(qū)或非常少的負(fù)分區(qū)時(shí)；

●當(dāng)你觀察到正負(fù)分區(qū)之間有很多雨滴時(shí)。

6.3濃度計(jì)算

設(shè)置閾值后，軟件自動(dòng)量化每個(gè)目標(biāo)的正分區(qū)和負(fù)分區(qū)的數(shù)量。然后，使用泊松分布將這個(gè)數(shù)字讀數(shù)轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)。每個(gè)結(jié)果都有一個(gè)95%的置信區(qū)間，它反映了測(cè)量的精度。該方法的精度也可由“95%置信區(qū)間”值給出，越小越好!每個(gè)樣本濃度的95%置信區(qū)間及其相關(guān)的相對(duì)不確定度由分析軟件自動(dòng)計(jì)算。如圖：

Evagreen數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、條件建立快而且成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是 由于DNA結(jié)合Evagreen為非特異性結(jié)合雙鏈DNA，所以Evagreen方法多用于低通量、單重實(shí)驗(yàn)。

 

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