蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南五

反相高效液相色譜和質(zhì)譜（MS）的聯(lián)用為蛋白質(zhì)/多肽分析提供了強(qiáng)大的工具。
20世紀(jì)80年代，約翰·貝內(nèi)特·芬恩和他的同事們開發(fā)了電噴霧離子源，使質(zhì)譜與反相高效液相色譜得以聯(lián)用。
采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的好處包括：

• 質(zhì)譜是非常靈敏的檢測(cè)技術(shù)。

• 質(zhì)譜可以提供所分離多肽/蛋白質(zhì)的分子量。

• 質(zhì)譜可利用分子量特異性檢測(cè)蛋白質(zhì)。

• 片段信息有助于確認(rèn)多肽。

• 質(zhì)譜基于電荷和質(zhì)量進(jìn)行分離和測(cè)定，因此，與基于疏水性分離的反相色譜“正交”。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用廣泛用于肽圖的分析，提供了一種正交檢測(cè)肽法（參考文獻(xiàn)15）。
如圖26所示，總離子質(zhì)量色譜圖與紫外色譜圖相似，但由于正交檢測(cè)的使用，峰的大小不同。
事實(shí)上，采用紫外檢測(cè)出現(xiàn)的小峰在質(zhì)譜圖中會(huì)更明顯（見圖26“^*”）。
 

圖26. 肽圖的分離可以通過(guò)紫外檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)。
峰高是檢測(cè)法的一個(gè)函數(shù)，在紫外圖譜和質(zhì)譜圖譜間有明顯不同。
特別是用“*”標(biāo)示的肽對(duì)。它們?cè)赨V檢測(cè)圖譜中顯示的峰值較小，但在質(zhì)譜圖中峰值較大。

 

通過(guò)測(cè)定每個(gè)峰中肽的分子量，質(zhì)譜分析法為識(shí)別RP-HPLC法分離的峰提供了有用的信息。
由于質(zhì)譜與反相高效液相色譜正交，因此質(zhì)譜還能確定峰純度或顯示兩種或兩種以上肽的共洗脫，并能提供肽的分子量。
圖27以肽圖中的三個(gè)峰值展示了這一點(diǎn)。A峰較早洗脫出來(lái)，是分子量為439道爾頓的四肽。B峰是一種糖肽，有寡糖或多聚糖吸附。
通過(guò)質(zhì)譜圖中B峰存在質(zhì)荷比為204和366兩種離子確定，這表明存在糖基化反應(yīng)。
C峰是一種二硫化物連接的二肽——由二硫鍵連接的兩個(gè)多肽。
顯示該肽有四種離子形式：+1、+2、+3和+4。只有含兩個(gè)氨基末端和兩個(gè)堿性氨基酸的二肽才會(huì)出現(xiàn)+4離子。

圖27. 反相色譜強(qiáng)大的分離能力與第二個(gè)維度的質(zhì)譜的結(jié)合為肽圖提供了大量的信息。

A. MS確認(rèn)A峰代表小分子肽。

B. 檢測(cè)到的B峰代表含多聚糖（糖）的肽。

C. C峰代表一種二肽——由二硫鍵連接的兩個(gè)肽。

 

HPLC-MS

 

聯(lián)用的兩個(gè)重要因素是電噴射接口的最佳流速及三氟乙酸對(duì)肽電離的影響

 

基本電噴霧接口的信號(hào)在5~10μL/min的流速區(qū)間上迅速下降（圖28）。
這與采用標(biāo)準(zhǔn)分析型HPLC柱的流速不相容。
目前，商用電噴霧提供一種高剪切流氮?dú)廨o助的電噴霧（氣流輔助電噴霧），它將電噴霧的最佳流速區(qū)間提升到了200~500μL/min。
這仍然低于標(biāo)準(zhǔn)分析柱通常所用的最佳流速，因此，目前科學(xué)家在使用HPLC-MS時(shí)，普遍采用流速為200~300μL/min的細(xì)孔柱（內(nèi)徑~2 mm）

 

圖28. 紅線表示基本電噴霧接口流速與信號(hào)響應(yīng)的關(guān)系。藍(lán)線同樣表示氣流輔助電噴霧的信號(hào)響應(yīng)。

 

 

 

如圖29所示，流動(dòng)相中的TFA流入電噴霧接口導(dǎo)致蛋白質(zhì)和多肽的信號(hào)減弱。
這是由于TFA和多肽間強(qiáng)烈的相互作用將多肽中和。

圖29. 使用電噴霧接口時(shí)，TFA的流入會(huì)大幅減弱多肽的信號(hào)。

 

 

有兩種方法可糾正由TFA引起的信號(hào)減弱：

• 忽略信號(hào)損失。通常，當(dāng)信號(hào)足夠強(qiáng)大時(shí)，即使信號(hào)減弱也仍能獲得有用的數(shù)據(jù)。在這種情況下可以忽略信號(hào)損失。

• 當(dāng)信號(hào)損失過(guò)多時(shí)，最佳的解決方案是將高純度硅膠柱與低濃度TFA結(jié)合使用。
  高純度硅膠柱與低濃度TFA一同使用仍能維持較好的峰形（圖30）。
  采用高純度硅膠柱能得到良好的信號(hào)響應(yīng)和峰形。

其它方案包括用甲酸代替TFA或柱后采用乙酸或丙酸代替TFA。
但采用甲酸得到的峰形不如TFA，分離度也不如TFA，因此會(huì)影響性能。
這在蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用中可以接受，但在蛋白質(zhì)治療藥物中不可行。
柱后替換TFA較為棘手，且會(huì)導(dǎo)致分辨率下降。

圖30. 高純度硅膠與低濃度TFA一同使用，保持肽的峰形。

 

 

色譜柱：ACE 5 C18, 4.6 x 250 mm（高純度硅膠）

洗脫液：加入如圖所示的TFA，以10%-55%的乙腈（ACN）梯度洗脫，洗脫時(shí)間為37.5分鐘。