蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南九

二硫鍵測定

蛋白質(zhì)依靠正確的二硫鍵鍵合維持其三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性。

如果二硫鍵被還原或交換，則蛋白質(zhì)會(huì)失去天然三級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性。

HPLC保留值取決于蛋白質(zhì)“疏水腳”的大小（圖41），它會(huì)受到三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

二硫鍵的改變通常會(huì)使“疏水腳”增大，從而使蛋白質(zhì)在反相HPLC中的保留值增大。

圖42中，天然白細(xì)胞介素II的出峰遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于被還原的白細(xì)胞介素II，這是由于當(dāng)二硫鍵被還原時(shí)，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

圖41. 蛋白質(zhì)保留值取決于“疏水腳”的大小。被還原的二硫鍵會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生部分變性，這將增大“疏水腳”和反相保留值。

圖42. 隨著二硫鍵的還原，白細(xì)胞介素II的“疏水腳”會(huì)增大，從而增加蛋白質(zhì)在反相HPLC上的保留值。

條件

色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米

流動(dòng)相：44.5%~50.8% 乙腈，以2 ml/min的流速進(jìn)行90分鐘的梯度洗脫

樣品：白細(xì)胞介素II突變蛋白質(zhì)

圖43. 對(duì)二硫鍵合正常和發(fā)生二硫鍵交換的類胰島素生長因子的分離。

條件

色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米

流動(dòng)相：20~38% 乙腈：異丙醇（88:12）—0.1% TFA體系，梯度洗脫，27分鐘。

即使是細(xì)微的二硫鍵改變也足以對(duì)疏水腳產(chǎn)生影響，從而改變保留值。
天然類胰島素生長因子（IGF）的Cys52和Cys47以及Cys48和Cys6之間都有二硫鍵（圖43A紅色部分所示）。
經(jīng)過36小時(shí)的空氣氧化，一些IGF蛋白分子內(nèi)出現(xiàn)了二硫鍵交換，變成了Cys52和Cys48以及Cys47和Cys6間的二硫鍵鍵合（圖43A藍(lán)色部分）。
發(fā)生了二硫鍵交換的IGF比天然IGF出峰晚（圖43），表明了疏水腳的增大。
天然蛋白的反相色譜法通常以反相保留值的變化揭示二硫鍵或蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。
 

在蛋白酶水解蛋白過程中（通過省去DTT和羧甲基化過程），如果二硫鍵未被還原，則肽圖中仍會(huì)包含二硫鍵合的二肽。
分別比較二硫鍵未還原和還原的肽圖能夠確定二硫鍵的位置。
在二硫鍵還原和未還原條件下水解白細(xì)胞介素II，通過RP-HPLC法得到兩種水解產(chǎn)物的肽圖（圖44）。
圖44A中，以T7+T10標(biāo)記出的肽是一種二硫鍵合的二肽。
在二硫鍵被還原的條件下得到的肽圖顯示了兩種肽，分別為T7和T10（圖44B）。
這證實(shí)了二硫鍵存在于這兩種肽之間。
監(jiān)測蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物肽能夠確定各個(gè)二硫鍵在蛋白質(zhì)中的位置。
如果一個(gè)胰蛋白酶肽段內(nèi)存在兩個(gè)半胱氨酸，則必須利用另一種蛋白酶確定參與到二硫鍵中的半胱氨酸。

通常將肽圖分析和質(zhì)譜法聯(lián)用確定二硫鍵的位置和狀態(tài)。

圖44. 分別比較二硫鍵未還原（A圖）和還原（B圖）情況下白細(xì)胞介素II的肽圖。

條件

色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米

流動(dòng)相：5~80% 乙腈—0.1% TFA體系，混合梯度洗脫，99分鐘。

樣品：

A二硫鍵未還原情況下白細(xì)胞介素II的肽圖。

B二硫鍵還原情況下白細(xì)胞介素II的肽圖。