蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南十一

蛋白質(zhì)組學(xué)
蛋白質(zhì)組學(xué)是鑒定和定量細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)的科學(xué)，目的是了解生物學(xué)變化和疾病狀態(tài)，開(kāi)發(fā)疾病的生物標(biāo)記和治療藥物的靶點(diǎn)。

如果將一個(gè)基礎(chǔ)蛋白的各個(gè)修飾蛋白算作一個(gè)蛋白，那么哺乳動(dòng)物細(xì)胞含多達(dá)3~4萬(wàn)個(gè)蛋白。當(dāng)計(jì)算各個(gè)修飾后的蛋白時(shí)，蛋白質(zhì)的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了10萬(wàn)。
細(xì)胞內(nèi)不同蛋白質(zhì)的豐度或濃度可能因不同的數(shù)量級(jí)而變化。
細(xì)胞系統(tǒng)的任何變化，如老化、患病或接受藥物治療等均會(huì)導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)豐度或表達(dá)發(fā)生變化。
蛋白質(zhì)組學(xué)旨在鑒定細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)的蛋白質(zhì)，并識(shí)別和監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的變化，如對(duì)蛋白質(zhì)的修飾（翻譯后修飾）或蛋白質(zhì)相對(duì)濃度的變化。
如果某一事件使蛋白質(zhì)豐度增加，那么我們就說(shuō)該事件上調(diào)蛋白表達(dá)。如果某一事件使蛋白質(zhì)豐度降低，那么我們就說(shuō)該事件下調(diào)蛋白表達(dá)。
受細(xì)胞變化影響時(shí)，蛋白質(zhì)豐度可能會(huì)發(fā)生顯著變化，蛋白質(zhì)豐度的變化是事件變化的信號(hào)。

翻譯后修飾（PTM）是指蛋白質(zhì)在翻譯后的化學(xué)修飾。
PTM包括寡糖鏈的添加（糖基化）、醋酸鹽等含烷基蛋白質(zhì)N-端的修飾（乙�；�等）、絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸上磷酸基團(tuán)的加入（磷酸化）等相似活動(dòng)。
磷酸化等PTM活動(dòng)在很大程度上是臨時(shí)性的，用于細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信息的傳遞。
糖基化等PTM活動(dòng)為結(jié)構(gòu)性改變，通常影響蛋白質(zhì)折疊、與其他分子的相互作用以及與細(xì)胞壁的相互作用。
所有這些代表了活細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化。

蛋白質(zhì)組表示細(xì)胞內(nèi)或任何研究樣品中全部的蛋白質(zhì)。
一個(gè)完整的細(xì)胞蛋白質(zhì)組由40000種單個(gè)蛋白質(zhì)組成，具有多達(dá)10~20種不同的修飾形式，豐度也因數(shù)量級(jí)的不同而變化。
蛋白質(zhì)組學(xué)的目標(biāo)顯然是巨大的，要求最強(qiáng)大的分離和分析技術(shù)。

電泳A
為了實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定和/或定量，必須盡可能地將單個(gè)蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)分離。
很多年來(lái)，凝膠電泳法均為分離完整蛋白質(zhì)的初級(jí)手段。
雙向凝膠電泳（2DGE）根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（第一向）和分子量（第二向）實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離（見(jiàn)圖48）。
完整細(xì)胞蛋白質(zhì)組的2DGE相當(dāng)復(fù)雜，且在分離多達(dá)2000~3000個(gè)蛋白質(zhì)的同時(shí)，很難實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)間的相互分離，或由于某些蛋白質(zhì)豐度低而很難在凝膠上看到。2DGE仍是強(qiáng)大的蛋白質(zhì)分離工具，它是一項(xiàng)發(fā)展成熟的技術(shù)，具有許多經(jīng)驗(yàn)豐富的用戶，能夠?qū)崿F(xiàn)高分辨率和多種蛋白質(zhì)的定量。
目前，2DGE的局限性是其不僅耗時(shí)而且費(fèi)力，主要衡量豐度更高的蛋白質(zhì)，較難實(shí)現(xiàn)膜結(jié)合蛋白等重要蛋白質(zhì)的衡量。

圖48. 雙向凝膠電泳可分離出多達(dá)2000~3000種單個(gè)蛋白質(zhì)。
每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。

橫向分離由等電點(diǎn)引起，與電荷有關(guān)。

縱向分離由分子量大小引起（SDSPAGE）。
分子量較小的蛋白質(zhì)移到凝膠底部，而分子量較大的蛋白質(zhì)留在凝膠頂部。

色譜分析
色譜技術(shù)已發(fā)展成一種強(qiáng)大的分離技術(shù)，能夠分離大量蛋白質(zhì)和多肽。
但任何一種單獨(dú)的色譜技術(shù)仍然只能分離出一小段蛋白質(zhì)。
因此，多種色譜技術(shù)的結(jié)合使用已成為蛋白質(zhì)組分析中蛋白質(zhì)分離的一種普遍方法。

二維色譜
在長(zhǎng)期的蛋白質(zhì)純化模式的基礎(chǔ)上，John Yates和同事開(kāi)發(fā)了一種名為多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)（MudPIT）的蛋白質(zhì)組分析技術(shù)。
在該技術(shù)中，采用胰蛋白酶等蛋白水解酶首先將蛋白質(zhì)組中的蛋白質(zhì)水解成分子量相對(duì)較小的多肽。
隨后利用離子交換色譜法通過(guò)逐步增加鹽濃度將這些肽分離。
每一步，略提高鹽濃度，將結(jié)合能力較弱的肽洗脫至反相磁珠。流動(dòng)相為乙腈梯度洗脫液，借助疏水性洗脫多肽。
MudPIT 法中，依次將離子交換磁珠和反相磁珠裝入毛細(xì)管柱，從反相部分流出的洗脫液直接進(jìn)入電噴霧質(zhì)譜儀（圖49）。
這一過(guò)程重復(fù)多次，能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)組水解產(chǎn)物肽的重要分離（圖50）。

二維色譜法分離蛋白酶水解產(chǎn)物多肽的優(yōu)點(diǎn)是將蛋白質(zhì)分解成肽,允許凝膠電泳法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的蛋白質(zhì)分離和鑒定，例如一些疏水性膜結(jié)合蛋白和低豐度蛋白。
缺點(diǎn)是有關(guān)PTM的信息通常在MudPIT法中丟失。
此外，形成肽的數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于蛋白質(zhì)，平均每個(gè)蛋白質(zhì)水解得到20~50個(gè)肽，且必須分離。

圖49. 多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)（MudPIT）包括通過(guò)離子交換色譜法實(shí)現(xiàn)的整個(gè)蛋白質(zhì)組蛋白酶水解產(chǎn)物的初步分離以及對(duì)離子交換分離出片段中多肽的反相分離。
將離子交換磁珠和反相磁珠裝入毛細(xì)管柱，從反相部分流出的洗脫液直接進(jìn)入電噴霧質(zhì)譜儀。

圖50. 在多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)（MudPIT）中，鹽濃度的逐步增加會(huì)使多肽洗脫至柱的反相部分，且乙腈梯度洗脫液會(huì)根據(jù)疏水性分離多肽。

PTM信息通常在 MudPIT 法中丟失。
此外，形成肽的數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于蛋白質(zhì)，平均每個(gè)蛋白質(zhì)水解得到20~50個(gè)肽，且必須分離。

較先進(jìn)的做法是使用親和色譜法，固定金屬親和層析和卵磷脂親和層析，以在離子交換分離前或后期進(jìn)一步分離多肽的亞片段。

蛋白質(zhì)鑒定
用凝膠電泳法分離的蛋白質(zhì)通常用蛋白酶水解（多數(shù)情況下為胰蛋白酶），通過(guò) MALDI 質(zhì)譜分析得到的多肽，并借助蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定。

通過(guò)MudPIT和相關(guān)方法分離的肽進(jìn)入電噴霧質(zhì)譜儀，并借助蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)質(zhì)譜法和串級(jí)質(zhì)譜法鑒定。
當(dāng)鑒定出某種蛋白質(zhì)的幾種肽時(shí)，可相應(yīng)鑒定出該種蛋白質(zhì)。