單堿基基因編輯技術(shù)之工具篇

前言
今年5月，David R. Liu教授與張鋒教授等人聯(lián)合創(chuàng)立Beam Therapeutics公司，再一次將“單堿基編輯技術(shù)”送上了熱搜榜，趁著熱度還未散去，我們繼上一期“單堿基編輯技術(shù)淺談”后，又為大家準(zhǔn)備了一篇超級實(shí)用性的深度分析，帶你一起看看單堿基編輯的前世今生及如何一步步發(fā)展壯大的歷程！希望大家看后能對單堿基編輯技術(shù)有一個(gè)更全面的認(rèn)識。


單堿基基因編輯技術(shù)（base editors，BEs）
單堿基基因編輯技術(shù)，顧名思義，指能在基因組上引起單個(gè)堿基改變的基因編輯技術(shù)�；�本原理是將胞嘧啶脫氨酶（APOBEC）或腺苷脫氨酶與現(xiàn)存Cas9n(D10A)融合而形成，依賴于CRISPR原理使得靶點(diǎn)遠(yuǎn)離PAM端的4-7位的單個(gè)堿基發(fā)生修改的基因編輯技術(shù)。


目前的單堿基基因編輯包括兩種:
1. CBEs(Cytidine base editors)（圖-1）[1]--嘧啶堿基轉(zhuǎn)換技術(shù)（C/G到T/A）:

2. ABEs(Adenine base editors)（圖-2）[2]-嘌呤堿基轉(zhuǎn)換技術(shù)（A/T到G/C）:
相對于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9的優(yōu)勢：
 

	傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9	單堿基編輯技術(shù)
編輯效率	細(xì)胞：0.1-5%； 胚胎：70%-80%	細(xì)胞：70-80%； 胚胎：100%
插入與缺失突變	較高	較低
脫靶效應(yīng)	較高	較低

單堿基編輯技術(shù)工具的發(fā)展及優(yōu)化歷程：

單堿基基因編輯技術(shù)自2016年4月被報(bào)道以來，迅速成為基因編輯技術(shù)領(lǐng)域的一顆璀璨的“明星”。其技術(shù)的發(fā)展核心主要是工具的不斷優(yōu)化。下面具體介紹：

第一類：嘧啶堿基轉(zhuǎn)換工具-- CBE (Cytidine base editor)的優(yōu)化歷程
l 2016年4月： David Liu 實(shí)驗(yàn)室首先報(bào)道了基于來源于大鼠胞嘧啶脫氨酶與CRISPR/Cas9 融合形成的單堿基基因編輯工具(Cytidine base editors, CBEs)，包括BE1, BE2,BE3。其中在他們實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的BE3(圖-3)，效率最高，也是目前應(yīng)用的最為廣泛的嘧啶堿基編輯工具，目前BE3已應(yīng)用到基因編輯編輯，基因治療，動(dòng)物模型制作及功能基因篩選等領(lǐng)域。
l 2016年 8月：日本科學(xué)家 Keiji Nishida 等將來源于七鰓鰻的胞嘧啶脫氨酶與 CRISPR/Cas9和尿嘧啶糖苷酶抑制劑融合，該系統(tǒng)可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn) 15%-55%靶向突變[3]。
l 2016年 10月：常興課題組將人源胞嘧啶脫氨酶融合 dCas9 的 C 端 (dCas9-AIDx)形成的TAM(targeted AID-mediated mutagenesis)可通過同樣可在遠(yuǎn)離PAM的5-9位產(chǎn)生C到T,A,G的突變[4]。
l 2016年 11月：報(bào)道的 CRISPR-X(圖-4)，將來源于人的胞嘧啶脫氨酶突變體去除出核信號后融合到MS2蛋白上，通過 MS2 RNA 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)招募到sgRNA 的骨架中，經(jīng)優(yōu)化后的CRISPR-X, 可以引起+20到+40bp 窗口內(nèi)實(shí)現(xiàn)平均20.6%的突變效率[5]。

l 2016年 11月：楊璐菡團(tuán)隊(duì)等將TALE, Zinc-finger DNA特異識別單元與來源于人的胞嘧啶脫氨酶進(jìn)行融合，可在細(xì)菌和人的細(xì)胞中分別實(shí)現(xiàn) 13% 和 2.5%的 C 到 T 的突變效率[6]，這可能是由于胞嘧啶脫氨酶的底物是單鏈DNA, 而 TALE和 Zinc-finger 無法打開雙鏈 DNA從無法使單鏈DNA暴露于胞嘧啶脫氨酶，影響了脫氨酶的效率，進(jìn)而影響了C 到 T 的轉(zhuǎn)換效率。
l 2017年1 月： 同時(shí)David Liu 實(shí)驗(yàn)室也在積極探索不受PAM限制的新型高效的單堿基因組編輯工具， 如VQR-BE3(PAM: NGAN), SaKKH-BE3(NNNRRT)等。 同時(shí)，他們也通過胞嘧啶脫氨酶功能域進(jìn)行氨基酸突變進(jìn)而篩選到編輯窗口能精確到1-2堿基的單堿基工具，其中以YE1-BE3（W90Y+R126E）為最優(yōu)，保持與BE3相似編輯活性的同時(shí)，將編輯窗口精確到1-2個(gè)堿基[7]。
l 2018年5 月：上�？萍即髮W(xué)陳佳實(shí)驗(yàn)室將Cpf1與胞嘧啶脫氨酶進(jìn)融合，由于Cpf1特殊結(jié)構(gòu)，無法設(shè)計(jì)成切口靶向鏈而將非靶向鏈暴露于脫氨酶，因此，最初的Cpf1-Apobec1效率并不高，這一點(diǎn)與TALE-AID類似。但通過將核定位信號引入Cpf1-Apobec1改造為dCpf1-BEs (圖-5)使其工作效率最高可達(dá)40%以上[8]，因此，表明NLS的引入在單堿基基因編輯中有著至關(guān)重要的作用。

l 通過擴(kuò)充PAM的CBE，將使CBE工具的使用更加靈活。 但由于CBE固有的原理，即胞嘧啶發(fā)生脫氨基時(shí)，隨后將刺激細(xì)胞內(nèi)的切除修復(fù)，因而在堿基編輯過程中不可避免的產(chǎn)生較低頻的indels及非預(yù)期突變（C到G,A的突變），降低了其產(chǎn)物純度。 鑒于此，2017年8月， David Liu 實(shí)驗(yàn)室及陳佳實(shí)驗(yàn)室通過優(yōu)化linker 及UGI的表達(dá)量，通過抑制內(nèi)源糖苷酶活性，得到BE4 和eBE-S3(圖-6)均可以不同程度地降低indels及非預(yù)期突變，提高其產(chǎn)物純度[9, 10]。


因引，經(jīng)過科學(xué)家們對CBE工基礎(chǔ)上進(jìn)行了深入的挖掘和優(yōu)化，目前的CBE已可以做到較高的編輯效率，較高的產(chǎn)物純度，較精確的編輯窗口，較靈活PAM選擇，這在精確堿基替換方面展示了無可替代的優(yōu)勢。

第二類：嘌呤堿基轉(zhuǎn)換工具--ABEs(Adenine base editors)的優(yōu)化歷程
對于2017年10月報(bào)道的嘌呤轉(zhuǎn)換工具-ABEs，它打破了過去單堿基編輯僅能編輯嘧啶堿基的限制。 僅僅過去半年之多， 其已經(jīng)在基因編輯，動(dòng)物模型制作，基因治療，植物的基因修飾等領(lǐng)域相續(xù)報(bào)道。 它的原理與CBE稍有不同，即腺嘌呤脫氨基之后為肌苷，在DNA水平被當(dāng)作G進(jìn)行讀碼復(fù)制，然而細(xì)胞內(nèi)對于肌苷的切除修復(fù)并不敏感，因此，ABEs能夠較為高效的產(chǎn)生A/T到G/C的突變，同時(shí)維持較高的產(chǎn)物純度。
l 2018年2月： David  Liu 實(shí)驗(yàn)室，考慮到僅有PAM仍然是其使用的一個(gè)限制，后來David Liu實(shí)驗(yàn)室將Cas9通過PACE進(jìn)化得到了不同氨基酸突變的xCas9 （圖-7）其中以xCas9 3.7最優(yōu)， 它不僅NGG PAM與傳統(tǒng)的Cas9保持相當(dāng)?shù)幕钚�，而且可以，識別 NGA,NGC,NGT, GAA,GAT, 同時(shí)保持較低的脫靶效應(yīng)，這樣可以靶向人類基因組范圍內(nèi)約的1/16的靶點(diǎn)。 之后將其與ABEs 融合，也同樣使ABEs PAM的選擇也更加靈活[11]。

展望ABEs的發(fā)展，就是回首看CBE的發(fā)展。因此，對于ABEs來講，更加靈活的PAM工具的開發(fā)，如 SaKKH(NNNRRT),Cpf1(TTTN) 的融合，也顯得尤為必要。
l 2018年5月： 另外，最近David Liu實(shí)驗(yàn)室,在nature biotechnology報(bào)道通過密碼子優(yōu)化后的序列以及引入額外的核定位信號（雙分型）的base editors, 得到BE4max 和ABEmax可以分別提高1.9倍，1.3-7.9倍的堿基編輯效率[13]。
l 2018年 7月：報(bào)道了BE-Plus （圖-8），即將多個(gè)多肽GCN4與其抗體結(jié)合區(qū)分別融合Cas9n(D10A),Apobec1-UGI, 它可以募集多個(gè)拷貝的Apobec1-UGI的融合蛋白，這樣可以在靶點(diǎn)區(qū)3-16位 C/G 到T/C的轉(zhuǎn)變，可實(shí)現(xiàn)較大范圍內(nèi)單個(gè)堿基突變[12]。類比，將其運(yùn)用到ABEs當(dāng)中，也同樣可以實(shí)現(xiàn)較大范圍內(nèi)A/T到G/C的突變。

l 2018年7月3日：來自nature biotechnology上最新報(bào)道， 也同樣將密碼子優(yōu)化序列（圖-9-1）及核定位序列引入（圖-9-2）到單堿基中BE3中，以FNLS為例（圖-9-3），用慢病毒在較為難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中（如NIH3T3細(xì)胞）最高提高了約50倍的C到T 的突變（相對于BE3）（圖-9-2），使應(yīng)用更加廣泛[14]。這些優(yōu)化將促使單堿基基因編輯工具更加高效，靈活，通用。






單堿基編輯技術(shù)的應(yīng)用
點(diǎn)突變是引起人類遺傳病的主要原因之一。據(jù) ClinVar database顯示，C/G 到 T/A, A/T 到 G/C突變引起致病單核苷酸突變的分別占48%，14% （圖-10）。


也即是，這兩種類型的突變將極大可能被ABE或CBE進(jìn)行較正。因此，未來兩種高效靈活的單堿基工具將會(huì)在未來的基因治療中大顯身手。如β-血紅蛋白病， 它主要由于在成年人中β-globin基因突變導(dǎo)致功能異常所致。 目前已證實(shí) 高水平表達(dá)胎兒血紅蛋白（HbF）病被認(rèn)為治療β-血紅蛋白病的很有潛力的策略[15]。-198 T > C[16], -175 T > C[17]這些在β-globin的啟動(dòng)區(qū)的突變可以通過不同的機(jī)制提高 HbF的表達(dá)。而這些突變已被報(bào)道可以被單堿基工具ABE7.10高效編輯[2, 13]。因此，未來利用單堿基治療β-血紅蛋白�。ㄈ绲刂泻Ｘ氀�）將極有可能是一個(gè)絕佳的策略。

雖然，CBE或ABE單堿基編輯技術(shù)具有其強(qiáng)大的優(yōu)勢，但是離未來臨床疾病治療仍然還有很多問題需要解決。
1. 主要是以下幾點(diǎn)：如CBE，ABE體積都過大，在基因治療中需要進(jìn)行有效拆分后包裝進(jìn)AAV進(jìn)行體內(nèi)治療；
2. 典型的CBE,ABE 高效編輯窗口依然是4-7位， 是否可將實(shí)現(xiàn)窗口平移，以靶向基因組更為廣闊的空間也有待進(jìn)一步研究；
3. CBE可以通過突變胞嘧啶脫氨酶特定位點(diǎn)從而實(shí)現(xiàn)更加精確的1-2位的編輯窗口，而相對ABE的窗口最為精確也只能為4-7位，能否進(jìn)一步通過突變腺嘌呤脫氨酶特定位點(diǎn)從而實(shí)現(xiàn)更加精確的ABE的編輯窗口，有待進(jìn)一步研究。
4. 在CBE，ABE中雖然均能高效地編輯某些靶點(diǎn)，但并非所有靶點(diǎn)均能編輯，其高效靶點(diǎn)是否存在某種規(guī)律？是否也Cas9中靶點(diǎn)的選擇存在某種關(guān)系，也有待研究。
5. 目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)嘧啶與嘧啶，嘌呤與嘌呤之間互換，是否存在嘧啶與嘌呤之間的堿基互換，也有待進(jìn)一步研究；
6. 目前，Cas9蛋白結(jié)構(gòu)已知，胞嘧啶脫氨酶（APOBEC）或腺苷脫氨酶的蛋白結(jié)構(gòu)也未知，融合成相應(yīng)的CBE,ABE結(jié)構(gòu)也未知，因此，未來解析CBE,ABE的融合蛋白結(jié)構(gòu)深入理解單堿基編輯靶向識別與編輯機(jī)制，也意義重大。

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