生物鐘不停歇：通過研究斑馬魚來揭示視網膜生物鐘活性
晝夜節(jié)律和視網膜生物鐘
人類以及許多其他動物體，睡眠-清醒循環(huán)以及其他的生物節(jié)律過程是由內源性振蕩器-生物鐘所調節(jié)的。生物鐘受一系列基因控制，這些基因的表達因是否有光照所微調，從而使得每日的生物節(jié)律適應于日夜循環(huán)交替。
在哺乳動物的大腦中，生物鐘母鐘（主要的控制因子）位于下丘腦視交叉上核。然而它并非每日節(jié)律的單一控制因子。體內還有其他的一些節(jié)律振蕩器，比如視網膜生物鐘，調節(jié)神經視網膜的很多生理活動。
斑馬魚的視網膜生物鐘
盡管普遍認為視網膜生物鐘響應外部光線強弱調節(jié)視覺靈敏度，但對其明確的機理和基因作用了解甚少。斑馬魚的視網膜結構以及功能和哺乳動物包括人類近似，這是將斑馬魚作為視網膜生物鐘實驗研究模型的重要優(yōu)勢。因此斑馬魚視網膜節(jié)律基因的研究對于人類視網膜生物鐘的認識可能具有重要意義。
值得提及的是，合肥微尺度物質科學國家實驗室和中國科學院腦功能與疾病重點實驗室的黃姓研究員等人最近研究了斑馬魚的Per 2基因。 Per 2基因被認為對視網膜生物鐘機制具有重要作用。 這個基因片段是光調節(jié)基因，在持續(xù)的無光條件下，Per 2基因的表達會被極大抑制。
斑馬魚的視網膜
創(chuàng)造斑馬魚的基因突變體來研究視網膜生物鐘
研究某指定基因片段的功能通常是創(chuàng)造一個缺失該基因的表型來和自然存在的最普遍的野生表型對比。黃姓研究員等人就是采用了該方法。他們制作了缺失Per 2基因的斑馬魚幼體，進行了各種解剖學，分子生物學以及行為表現(xiàn)研究來比對突變表型和野生表型。
斑馬魚的Visiobox和Zebrabox的測試
黃姓研究員等人做的行為分析的其中一項是視動力反應測試(OKR)。測試分析可以反映視力和對比敏感度。在這項測試中，斑馬魚幼體被固定在下面有紅外線光源的培養(yǎng)皿里。光源在幼體周圍發(fā)射出旋轉光柵。光柵引起眼球運動，會被紅外敏感CCD鏡頭實時捕捉。在不同的空間頻率（0.02, 0.04, 0.06, 0.08周/度）條件下測試視力情況。對比敏感度用‘Gain’值（增益）也就是眼球運動速度與刺激條紋速度的比值來衡量。此項實驗項目更好的選擇是采用Viewpoint公司所研發(fā)的Visiobox產品，該產品致力于改善實驗的精確度，分析方法以及再現(xiàn)性。其都將歸功于Visiobox強大的自動觀測和跟蹤斑馬魚幼體的視覺行為的功能。
VisioBox系統(tǒng)影像輸出斑馬魚的視動反應測試（OKR）
黃姓研究員團隊也進行了斑馬魚幼體的視覺運動反應（VMR）的實驗研究。該研究是使用ZebraBox系統(tǒng)進行的。ZebraBox可以實現(xiàn)自動觀測和跟蹤斑馬魚幼體，同時研究數(shù)量可多達96條。采用這個技術可以實現(xiàn)實驗條件的全方位控制。斑馬魚幼體（突變表型和野生表型）被分別放置在96個孔板里。在正式實驗之前，這些幼體被置于ZebraBox系統(tǒng)提供的完全無光條件下3.5小時以適應該條件。之后突然瞬間調整光照條件。幼體的每一秒的動作都被系統(tǒng)一幀幀記錄下來。對斑馬魚幼體樣品的其他測試包括免疫組織化學，實時熒光定量PCR，電鏡成像等，這樣可以觀測視網膜的結構成分和基因表達。
斑馬魚仔魚行為觀察箱(ZebraBox)
數(shù)據(jù)分析
在對行為數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析之后，黃姓研究員等人確定了缺乏per 2基因片段的個體會在白天表現(xiàn)出對比敏感度減弱的跡象以及視力低下。但即使缺乏per 2基因片段仍然具備視動力反應晝夜節(jié)律。
針對Per 2基因突變體在light-on模式（光電傳感器動作模式）視覺運動反應表現(xiàn)出缺陷的情況，他們決定對視網膜結構變化進行研究，他們認為視網膜結構的變化可能是引起視力減弱的原因。通常認為視網膜異常的突觸帶可能導致了視力低下，因此他們進行了解剖學和分子生物學研究。果然，黃姓研究員團隊發(fā)現(xiàn)在突變體中，突觸帶和突觸后進程沒有聯(lián)系，甚至和拱形致密區(qū)以及突觸前膜沒有關聯(lián)。他們推斷per 2基因對于錐形視蛋白的表達有重要作用，因此導致了視網膜結構變化。
數(shù)據(jù)轉化結論
根據(jù)上面提及到的，研究證明時鐘基因對視網膜形成視覺的功能很重要。缺失per 2基因的斑馬魚突變體表現(xiàn)出對比敏感度和視力低下的情況。尤其缺失per 2基因的斑馬魚在白天的的視動力反應測試的gain值降低。然而，它們即使缺乏per 2基因片段仍然具備視動力反應晝夜節(jié)律。這有可能是因為per 2基因片段對于分子鐘或者行為節(jié)律影響不大。另外，per 2突變體表現(xiàn)出視網膜突觸帶異常和數(shù)量減少的現(xiàn)象，這可能是導致視力低下的原因。
該研究的未來展望
綜上所述，per 2基因突變的斑馬魚盡管在視網膜中時鐘基因的節(jié)律表現(xiàn)正常，但因異常的突觸帶而變現(xiàn)出來視力低下的情況。從數(shù)據(jù)來看，時鐘基因影響了視覺功能，是因為阻礙了神經發(fā)育而并非是晝夜節(jié)律失調。研究闡述了per 2基因在調節(jié)視覺過程中的主要作用機制。為未來視網膜生物鐘控制的準確遺傳學機理研究以及將經驗類推到哺乳動物甚至人類身上開辟了新的思路。
參考文獻
Huang D, Wang M, Yin W, Ma Y, Wang H, Xue T, Ren D and Hu B. (2018). Zebrafish Lacking Circadian Gene per2 Exhibit Visual Function Deficiency. Front. Behav. Neurosci. 12:53. doi: 10.3389/fnbeh.2018.00053
人類以及許多其他動物體，睡眠-清醒循環(huán)以及其他的生物節(jié)律過程是由內源性振蕩器-生物鐘所調節(jié)的。生物鐘受一系列基因控制，這些基因的表達因是否有光照所微調，從而使得每日的生物節(jié)律適應于日夜循環(huán)交替。
在哺乳動物的大腦中，生物鐘母鐘（主要的控制因子）位于下丘腦視交叉上核。然而它并非每日節(jié)律的單一控制因子。體內還有其他的一些節(jié)律振蕩器，比如視網膜生物鐘，調節(jié)神經視網膜的很多生理活動。
斑馬魚的視網膜生物鐘
盡管普遍認為視網膜生物鐘響應外部光線強弱調節(jié)視覺靈敏度，但對其明確的機理和基因作用了解甚少。斑馬魚的視網膜結構以及功能和哺乳動物包括人類近似，這是將斑馬魚作為視網膜生物鐘實驗研究模型的重要優(yōu)勢。因此斑馬魚視網膜節(jié)律基因的研究對于人類視網膜生物鐘的認識可能具有重要意義。值得提及的是，合肥微尺度物質科學國家實驗室和中國科學院腦功能與疾病重點實驗室的黃姓研究員等人最近研究了斑馬魚的Per 2基因。 Per 2基因被認為對視網膜生物鐘機制具有重要作用。 這個基因片段是光調節(jié)基因，在持續(xù)的無光條件下，Per 2基因的表達會被極大抑制。
斑馬魚的視網膜
創(chuàng)造斑馬魚的基因突變體來研究視網膜生物鐘
研究某指定基因片段的功能通常是創(chuàng)造一個缺失該基因的表型來和自然存在的最普遍的野生表型對比。黃姓研究員等人就是采用了該方法。他們制作了缺失Per 2基因的斑馬魚幼體，進行了各種解剖學，分子生物學以及行為表現(xiàn)研究來比對突變表型和野生表型。
斑馬魚的Visiobox和Zebrabox的測試
黃姓研究員等人做的行為分析的其中一項是視動力反應測試(OKR)。測試分析可以反映視力和對比敏感度。在這項測試中，斑馬魚幼體被固定在下面有紅外線光源的培養(yǎng)皿里。光源在幼體周圍發(fā)射出旋轉光柵。光柵引起眼球運動，會被紅外敏感CCD鏡頭實時捕捉。在不同的空間頻率（0.02, 0.04, 0.06, 0.08周/度）條件下測試視力情況。對比敏感度用‘Gain’值（增益）也就是眼球運動速度與刺激條紋速度的比值來衡量。此項實驗項目更好的選擇是采用Viewpoint公司所研發(fā)的Visiobox產品，該產品致力于改善實驗的精確度，分析方法以及再現(xiàn)性。其都將歸功于Visiobox強大的自動觀測和跟蹤斑馬魚幼體的視覺行為的功能。
VisioBox系統(tǒng)影像輸出斑馬魚的視動反應測試（OKR）
黃姓研究員團隊也進行了斑馬魚幼體的視覺運動反應（VMR）的實驗研究。該研究是使用ZebraBox系統(tǒng)進行的。ZebraBox可以實現(xiàn)自動觀測和跟蹤斑馬魚幼體，同時研究數(shù)量可多達96條。采用這個技術可以實現(xiàn)實驗條件的全方位控制。斑馬魚幼體（突變表型和野生表型）被分別放置在96個孔板里。在正式實驗之前，這些幼體被置于ZebraBox系統(tǒng)提供的完全無光條件下3.5小時以適應該條件。之后突然瞬間調整光照條件。幼體的每一秒的動作都被系統(tǒng)一幀幀記錄下來。對斑馬魚幼體樣品的其他測試包括免疫組織化學，實時熒光定量PCR，電鏡成像等，這樣可以觀測視網膜的結構成分和基因表達。
斑馬魚仔魚行為觀察箱(ZebraBox)
數(shù)據(jù)分析
在對行為數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析之后，黃姓研究員等人確定了缺乏per 2基因片段的個體會在白天表現(xiàn)出對比敏感度減弱的跡象以及視力低下。但即使缺乏per 2基因片段仍然具備視動力反應晝夜節(jié)律。
針對Per 2基因突變體在light-on模式（光電傳感器動作模式）視覺運動反應表現(xiàn)出缺陷的情況，他們決定對視網膜結構變化進行研究，他們認為視網膜結構的變化可能是引起視力減弱的原因。通常認為視網膜異常的突觸帶可能導致了視力低下，因此他們進行了解剖學和分子生物學研究。果然，黃姓研究員團隊發(fā)現(xiàn)在突變體中，突觸帶和突觸后進程沒有聯(lián)系，甚至和拱形致密區(qū)以及突觸前膜沒有關聯(lián)。他們推斷per 2基因對于錐形視蛋白的表達有重要作用，因此導致了視網膜結構變化。
數(shù)據(jù)轉化結論
根據(jù)上面提及到的，研究證明時鐘基因對視網膜形成視覺的功能很重要。缺失per 2基因的斑馬魚突變體表現(xiàn)出對比敏感度和視力低下的情況。尤其缺失per 2基因的斑馬魚在白天的的視動力反應測試的gain值降低。然而，它們即使缺乏per 2基因片段仍然具備視動力反應晝夜節(jié)律。這有可能是因為per 2基因片段對于分子鐘或者行為節(jié)律影響不大。另外，per 2突變體表現(xiàn)出視網膜突觸帶異常和數(shù)量減少的現(xiàn)象，這可能是導致視力低下的原因。
該研究的未來展望
綜上所述，per 2基因突變的斑馬魚盡管在視網膜中時鐘基因的節(jié)律表現(xiàn)正常，但因異常的突觸帶而變現(xiàn)出來視力低下的情況。從數(shù)據(jù)來看，時鐘基因影響了視覺功能，是因為阻礙了神經發(fā)育而并非是晝夜節(jié)律失調。研究闡述了per 2基因在調節(jié)視覺過程中的主要作用機制。為未來視網膜生物鐘控制的準確遺傳學機理研究以及將經驗類推到哺乳動物甚至人類身上開辟了新的思路。
參考文獻
Huang D, Wang M, Yin W, Ma Y, Wang H, Xue T, Ren D and Hu B. (2018). Zebrafish Lacking Circadian Gene per2 Exhibit Visual Function Deficiency. Front. Behav. Neurosci. 12:53. doi: 10.3389/fnbeh.2018.00053
