實驗動物分組的正確做法

導讀
實驗動物分組時，我們常常碰到以下情況：如有40只皮下荷瘤小鼠需隨機分為4組，但每只腫瘤體積大小各異；又如有50只SD大鼠，需要分5組，但性別和體重均不一，該如何將其隨機分配呢？對于大多數的我們，很可能會參雜人為因素對動物進行編號，殊不知這并不是一種科學的做法。原來實驗分組不像抓鬮擲硬幣，它需應用專門的隨機數字表，還包括完全隨機設計、隨機區(qū)組設計等隨機方法。本期就一起看看如何科學分組！

實驗動物分組是實驗設計中的一個非常重要的環(huán)節(jié)，美國動物委員會要求投稿時，需要對動物基本信息包括動物來源、品系、生活環(huán)境、分組方法等作出說明[1]。然而大多數發(fā)表的文章，都未描述實驗動物隨機分組方法，而被編輯索要原始數據來證明數據的可靠性[2]�？梢�，分組十分重要。那么實驗動物分組講究哪些原則，又該如何實施呢？

動物分組一般需要遵循對照和隨機的原則，這里主要關乎2個問題，一是如何設計對照組？二是如何保證動物隨機地分配到這些組中？

問題一： 如何設置對照組？

為了保證能得到科學有效的數據，分組的第一個設計原則便是要設立對照組。一般觀察一個藥物或者某種外界因素對實驗動物的影響需要設置3組對照，空白對照組（負對照組、     ）、模型對照組（正對照組）和陽性對照組[2]。

1. 空白對照組：指不經任何處理的實驗動物，目的是為了突出正常動物與疾病動物之間有何差別；如研究某種藥物對糖尿病小鼠的治療效果，該組即為未患有糖尿病的野生型小鼠，必要時可以給予生理鹽水或其它藥物的溶劑等。

2. 模型對照組：即疾病動物模型，給予陰性處理；目的是觀察與治療組相比，藥效如何及在疾病狀態(tài)下的動物表現(xiàn)；如要觀察某種藥物是否對乳腺癌有治療效果，治療組動物需要腹腔給藥，模型組則是注射同等劑量的不包括藥物的溶劑，如生理鹽水；

3. 陽性對照組：通常是給予疾病模型動物已知應該有效的藥物或者其他有效因素的處理；目的是對比某受試藥物與陽性藥物對比，是否有效；舉例：已知阿霉素對乳腺癌腫瘤生長有抑制作用，因此我們可以選用阿霉素作為陽性對照，來判斷此受試藥物的治療效果。

那么加上對照組，實驗設計一般共需要幾組？

實驗設計，除了設置上述對照組外，還需加上處理因素那一組，一般會設置劑量梯度，最好是設計3個以上，以形成劑量效應。綜上，建議分組是：①空白組，②模型組，③模型＋陽性藥物模型，④模型＋＋低劑量藥物，⑤模型＋中劑量藥物，⑥模型＋高劑量藥物。

• 注：如果實驗對象是不需要疾病狀態(tài)，則可不設立模型組；

• 注：并非每一個實驗都能找到陽性對照藥，因此，也不是每一個實驗都需要設置陽性對照組；

• 注：具體劑量設計，可以參考文末鏈接（藥物濃度的設計）

問題二： 每組幾只合適？

動物實驗設計應遵循實行“3R原則”，包括實驗動物的替代、減少和優(yōu)化原則，其中減少即指盡量減少實驗動物的數量。查閱文獻，并未發(fā)現(xiàn)對實驗動物數目有絕對要求，但在減少的同時，一定要滿足統(tǒng)計學要求。統(tǒng)計學上要求一般至少每組有6個可用數據，才有意義。

• 一般小鼠的每組一般不少于10只；

• 一般大鼠每組不少于6只；

• 大動物等級越高，價格越貴，根據情況可適當減少，但一般不能少于4-5只。

問題三： 如何進行隨機分配？

隨機分配可以保證數據的科學性，可以保證數據更有說服力，因此實驗動物分組應嚴格按照隨機原則進行，使每只動物都有同等機會被分配到各個實驗組中去。

根本不同的實驗目的，實驗對象，分組時常用的方法有：完全隨機設計、隨機區(qū)組設計等[3-4]。實現(xiàn)隨機分組時需要利用隨機數字表以及隨機數余數分組法。

什么是隨機數表？也稱亂數表，由計算機隨機生成的從0到9十個數字所組成的數表，每個數字在表中出現(xiàn)的次數概率基本相同。分組時，需要借用這個工具，實現(xiàn)隨機分配。

方法一：完全隨機設計 

通過隨機數字表或用計算機產生隨機數將動物不加區(qū)分地隨機分組[5]；

• 適用范圍：所有動物必須是“同質”或者近似“同質”。也就是說所有的動物性別、體重及其他相關因素（如荷瘤體積）是一樣的，或是近似的。

操作步驟：

1. 編號: 將實驗動物從1 到N 編號，一般可以可按體重大小編號；

2. 獲取隨機數字: 從隨機數字表中任意一個數開始，沿同一方向順序獲取N個隨機數字；

3. 求余數: 隨機數除以組數求余數，若整除則余數取組數；

4. 分組: 按余數分組；

5. 調整: 如不均分，繼續(xù)按順序抄下一個隨機數，除數變?yōu)閿的孔疃嗟哪墙M的數字a，得到的余數作為被抽的序號(若整除則余數為a)，直到調到相等為止。

舉例將15只小鼠分為3組：先按體重大小給動物編號，然后利用隨機表連續(xù)抄取15個數字，然后以組數3求余數，即除以3，余數1、2、3分別代表進入甲、乙及丙組。然而得甲組多一只（6只），查隨機數字表，下一個隨機數字為55。55/6余1，因此，將第1 例從甲組調整到丙組中去。

表：完全隨機法分組舉例

• 優(yōu)點：操作簡單，且能實現(xiàn)隨機分配的原則；

• 缺點：一是過程比較繁瑣，通常一次操作不能使各組的數目相等，需要調整；數目太多不易快速實現(xiàn)分組；且若動物間有較大差異，如體重區(qū)間較大，則不適用這種方法。

方法二：隨機區(qū)組設計 

然而如果一批小鼠中，小的有18g的，大的有30g的，體重相差比較大，若按上述完全隨機方法分配到各組，很可能有的組分到體重特別大的，有的組分到特別小的。這樣難以保證平均分配，因此隨機區(qū)組設計應運而生。

隨機區(qū)組設計：叫均衡隨機化或限制性隨機化，即先將一定數目和比例的動物分為幾個區(qū)組（block）（一般＞3），如體重相近的動物、性別一致的動物等。區(qū)組的長度最好為組數的2倍以上，太小易造成不隨機，如有4個組，則區(qū)組長度最好選擇8以上。

舉例：有40只SD大鼠，重量在180-220克之間，需要分為4組，即每組10只（甲乙丙�。�，應先將動物按體重配成若干個區(qū)組，再把每區(qū)組動物隨機分配各組。

1. 首先，進行大鼠稱重，按順序排序；

2. 分區(qū)組：嘗試可將這些大鼠按體重分為4個區(qū)組（假設180~190g/8只，190-200g/12只，200-210g/16只，210-220g/4只），即4窩，分區(qū)時每窩的數量至少大于4；

3. 編號：依次對這4窩大鼠編號，第一窩1、2、3、4…8，以此類推，編號到40；

4. 隨機分配區(qū)組1：將這8只隨機分配給4組，每組各2只，分組方法即采用上述隨機數字表，按隨機數余數分配到每個組；

5. 隨機分配剩余3個區(qū)組，方法同上。

• 優(yōu)勢：區(qū)間分組將保證了實驗組間的生物差異減到了最小，遵循了一致性原則與隨機性原則，使實驗結果更具有統(tǒng)計學意義。

• 注：有時候我們會碰到多個因素，則需要依次分區(qū)，如：40只體重差異較大的小鼠，雌雄不一，此時我們不能只按照體重區(qū)組分配，需要先把雌雄分開，然后各自按體重分層。即它要求隨機先按某一因素分成相等的幾組，再在組內按另一因素分成幾個區(qū)。

• 注：當數目較少時，我們可以手動計算分組；但是當數目太多時，我們需要借助軟件如excel或SPSS，省去了去查閱隨機數字表的麻煩，幾分鐘就可完成一個隨機分配過程。

綜上我們可以看到，實驗動物分組我們需要遵循對照和隨機的原則，這樣才可以保證數據更加具有科學性和統(tǒng)計意義，最好不要加入主觀因素進行分組。實驗動物分組作為實驗設計的重要環(huán)節(jié)，我們必須在實驗開始前就必須認真考慮清楚。希望大家通過我們的文章認識到隨機分組的重要性，并且可以在實踐中學會隨機分組。

參考文獻

[1] National Research Council. 2011. Guidance for the Description of Animal Research in Scientific Publications. Washington, DC: National Academies Press. Available online (http://www.ncbi-nlm.nih.gov/books/NBK84205/)

[2] Festing M F, Altman D G. Guidelines for the Design and Statistical Analysis of Experiments Using Laboratory Animals[J]. Ilar Journal, 2002, 43(4): 244-258.

[3] Michael F. W. Festing. Randomized Block Experimental Designs Can Increase the Power and Reproducibility of Laboratory Animal Experiments[J]. ILAR Journal, 2014.

[4] 趙偉，孫國志. 常用實驗動物隨機分組方法，實驗動物，2009年第4期

[5]萬霞, 劉建平. 臨床試驗中的隨機分組方法. 中醫(yī)雜志2007 年第48 卷第3 期