皮下荷瘤實驗的介紹及應用
腫瘤細胞系移植模型（CDTX）因易構建、成瘤率高、周期短等優(yōu)點而廣泛應用，并且目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多是通過該模型而被發(fā)現(xiàn)。本期咱們就首先為大家介紹，CDTX模型中看似最簡單卻深藏多種不確定因素的皮下荷瘤。
皮下荷瘤定義
腫瘤細胞系移植到同種或異種動物的皮下形成腫瘤塊，荷瘤是將腫瘤細胞移植到小鼠體內的專業(yè)說法，皮下荷瘤屬于腫瘤細胞系移植模型（CDTX），CDTX還包括各種轉移模型荷瘤、原位荷瘤等。
皮下荷瘤應用
一般用于抑制腫瘤生長（細胞增殖）的藥物的篩選檢測。如果單獨研究腫瘤在小鼠體內的生長，那么幾乎所有的腫瘤均可通過皮下荷瘤進行實驗研究。
第一部分：皮下荷瘤模型的幾個考慮因素
（1）腫瘤細胞系的選擇
腫瘤細胞株的選擇，是一個很麻煩的問題，卻是最重要的問題。有以下幾點要求：
① 不同腫瘤細胞系的成瘤率不同，需選取成瘤率高的細胞系；如乳腺癌細胞MCF-7，雖在體外應用多，但體內成瘤率差，生長慢，因此一般不選用；
② 腫瘤細胞根據分子標記分為多種，考慮成瘤率外，選擇時還需考慮實驗目的，如針對藥物靶點HER2，需要選擇HER2高表達的腫瘤細胞如SKBR-3，而不是HER2陰性的MDA-MB-231；再如研究靶向kras突變腫瘤的藥物，我們選取kras突變的（其突變類型又屬于突變率比較高的），又易培養(yǎng)且成瘤率好的A549。
③ 實驗用腫瘤細胞株多為人源或鼠源細胞系，根據實驗目的選擇，一般鼠源細胞系更易荷瘤，但是人源細胞系會更貼近人類腫瘤生長情況。
（2）小鼠品系的選擇
由于腫瘤細胞系主要分為人源和鼠源，因此小鼠品系的選擇要根據細胞系來源。
人源細胞系：為異種移植，應該選擇免疫缺陷的小鼠（如：nude，NOD/scid，NSG，詳情點
擊鏈接3.2 免疫缺陷動物（一）。
鼠源細胞系：為同種移植，選擇與腫瘤細胞系來源一致的小鼠（C57BL/6品系來源的黑色素
瘤細胞系B16F10就要選擇C57BL/6品系的小鼠）。不過裸鼠或其他免疫缺陷鼠的免疫系統(tǒng)
異常，不適用于篩選免疫調控藥物。
（3）接種部位
應選擇血管豐富且易操作的部位，如腋下、腹股溝、側腹部及頸背部等部位。其中腋下中部皮下較好，成瘤率高。如下圖所示：
Nude裸鼠腋下處皮下荷瘤（人源乳腺癌細胞系SKBR-3）
第二部分：裸鼠皮下荷瘤步驟
一般更多的時候是選擇人源腫瘤細胞系，然而由于存在免疫排斥，需選擇裸鼠荷瘤。
下面以裸鼠為例，為大家詳細介紹皮下荷瘤的實驗過程
⑴ 腫瘤細胞的傳代擴增
取凍存于液氮的腫瘤細胞復蘇并擴增，確保腫瘤細胞的活力和良好的生長狀態(tài)
⑵ 計算細胞接種量
根據經驗，一般鼠源腫瘤細胞接種2～100萬/只，而人源腫瘤細胞則需要200-1000萬/只以
上。當然最好結合文獻來確定細胞接種量，在找不到相關資料的情況下，最高就用到1000
萬/0.1ml，不可再高（因為細胞懸液已達飽和狀態(tài)）。并且提前計算確定細胞數(shù)量，一般注射40只小鼠，至少需要準備50只小鼠的細胞量。
⑶ 準備裸鼠
一般選擇5-6W裸鼠，小于4W動物可能不耐受而過早死亡，大于6W免疫力會增強，不
易成瘤；
每批實驗只用同一性別動物，通常雌雄均可，但是根據研究的腫瘤類型及腫瘤細胞系選擇（乳
腺癌等要選擇雌性，前列腺癌等要選擇雄性）
⑷ 操作步驟（請觀看視頻）
① 接種時選擇好部位進針，建議接種前酒精棉球擦拭消毒進針位置；
② 向前方穿行，注射前針頭稍微動一動，能動說明在皮下，否則可能在皮內或者肌肉內；
③ 針頭在皮下走一段再注射，速度不可太快，一般體積為100-200μL（PBS或者無血清培養(yǎng)基稀釋細胞，若不易成瘤可添加matrigel促進成瘤），可看見明顯的鼓包；
④ 接種點離進針點盡量較遠，減少漏液和污染的可能；
⑤ 注射完畢后，緩慢退出針頭，盡量避免漏液；
⑥ 細胞需一直置于冰上，使細胞處于比較低的代謝狀態(tài)，一般2h之內不會有問題。
下面為皮下荷瘤視頻（包括各個部位的注射手法）：
視頻
第三部分：后續(xù)實驗安排
⑴ 分組：一般來說皮下荷瘤主要用于抗腫瘤藥物的檢測，因此我們一般分為對照組，陽性藥物組，低劑量、中劑量及高劑量藥物組等；
⑵ 數(shù)量：荷瘤時每組不少于10只，考慮到小鼠成瘤率和死亡原因，最終實驗應至少可以獲取6個有效數(shù)據；
⑶ 給藥時間：一般接種7-10天后便可看到腫瘤長起，便可分組實驗（鼠源細胞系會更快）；
⑷ 人道終點：動物倫理學規(guī)定，小鼠腫瘤重量不可超過小鼠體重10%，平均腫瘤直徑
不超過20mm，并且如果出現(xiàn)潰爛，造成感染或壞死時，應該中止實驗且對動物施行安樂死。
補充正常免疫小鼠的荷瘤
基本步驟與裸鼠荷瘤一致，只是比較繁瑣的是，由于野生型小鼠有毛發(fā)，所以需要剃毛（如
上圖Balb/c小白鼠腹股溝皮下荷瘤鼠源結腸癌CT26）
第四部分： 皮下荷瘤的幾點問答
⑴ 瘤子長不出來是怎么回事？
一方面可能是細胞狀態(tài)差，活力不好，或是腫瘤細胞不易成瘤，需加入Matrigel輔助或增大接種量或更換細胞系；一方面可能是小鼠周齡太大，或小鼠免疫排斥，建議更換免疫缺陷程度更大的小鼠（Nod-scid小鼠，NOG小鼠＞ Nude裸鼠）
⑵ 小鼠瘤子長起來又消失？
腫瘤塊先縮小，后變大很常見，很可能是炎癥反應，腫瘤細胞被小鼠自身吸收，繼續(xù)觀察腫瘤細胞吸收之后是否經過幾周還能長出來，長不起來建議換鼠。
⑶ 均一性很差，腫瘤體積差距較大？
如果荷瘤分組發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤體積差距很大，這可能跟小鼠周齡及接種細胞量不一致導致，建議重新做實驗分組。
⑷ 是否可以在一只小鼠進行多個點荷瘤？
不可以，一只老鼠就只能接種一個點。因為一個老鼠身上有多個腫瘤塊的情況下，可能會相互影響。
⑸ 是否應用免疫抑制劑加速腫瘤生長？
如果裸鼠荷瘤不生長，可以參考文獻，用免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺（抑制裸鼠NK細胞活性）
促進生長；不過最好不要為了縮短造模周期來加速生長，因為可能會造成潰爛，這樣就不得
不中止實驗。所以一般情況下，應盡量符合細胞系本身的生長特性，不應過多地人為的干擾。
皮下荷瘤實驗介紹就到此結束了，原來看似簡單的實驗卻有多種不可忽視的因素需要考慮。
簡單回顧一下，皮下荷瘤模型中細胞系和小鼠品系是最需要考慮的兩大因素，切記一定要多
查閱文獻并結合預實驗，進而找到最合適的皮下腫瘤模型。
皮下荷瘤定義
腫瘤細胞系移植到同種或異種動物的皮下形成腫瘤塊，荷瘤是將腫瘤細胞移植到小鼠體內的專業(yè)說法，皮下荷瘤屬于腫瘤細胞系移植模型（CDTX），CDTX還包括各種轉移模型荷瘤、原位荷瘤等。
皮下荷瘤應用
一般用于抑制腫瘤生長（細胞增殖）的藥物的篩選檢測。如果單獨研究腫瘤在小鼠體內的生長，那么幾乎所有的腫瘤均可通過皮下荷瘤進行實驗研究。
第一部分：皮下荷瘤模型的幾個考慮因素
（1）腫瘤細胞系的選擇
腫瘤細胞株的選擇，是一個很麻煩的問題，卻是最重要的問題。有以下幾點要求：
① 不同腫瘤細胞系的成瘤率不同，需選取成瘤率高的細胞系；如乳腺癌細胞MCF-7，雖在體外應用多，但體內成瘤率差，生長慢，因此一般不選用；
② 腫瘤細胞根據分子標記分為多種，考慮成瘤率外，選擇時還需考慮實驗目的，如針對藥物靶點HER2，需要選擇HER2高表達的腫瘤細胞如SKBR-3，而不是HER2陰性的MDA-MB-231；再如研究靶向kras突變腫瘤的藥物，我們選取kras突變的（其突變類型又屬于突變率比較高的），又易培養(yǎng)且成瘤率好的A549。
③ 實驗用腫瘤細胞株多為人源或鼠源細胞系，根據實驗目的選擇，一般鼠源細胞系更易荷瘤，但是人源細胞系會更貼近人類腫瘤生長情況。
（2）小鼠品系的選擇
由于腫瘤細胞系主要分為人源和鼠源，因此小鼠品系的選擇要根據細胞系來源。
人源細胞系：為異種移植，應該選擇免疫缺陷的小鼠（如：nude，NOD/scid，NSG，詳情點
擊鏈接3.2 免疫缺陷動物（一）。
鼠源細胞系：為同種移植，選擇與腫瘤細胞系來源一致的小鼠（C57BL/6品系來源的黑色素
瘤細胞系B16F10就要選擇C57BL/6品系的小鼠）。不過裸鼠或其他免疫缺陷鼠的免疫系統(tǒng)
異常，不適用于篩選免疫調控藥物。
（3）接種部位
應選擇血管豐富且易操作的部位，如腋下、腹股溝、側腹部及頸背部等部位。其中腋下中部皮下較好，成瘤率高。如下圖所示：
Nude裸鼠腋下處皮下荷瘤（人源乳腺癌細胞系SKBR-3）
Balb/c小鼠腹股溝皮下荷瘤（鼠源結腸癌CT26）
第二部分：裸鼠皮下荷瘤步驟
一般更多的時候是選擇人源腫瘤細胞系，然而由于存在免疫排斥，需選擇裸鼠荷瘤。
下面以裸鼠為例，為大家詳細介紹皮下荷瘤的實驗過程
⑴ 腫瘤細胞的傳代擴增
取凍存于液氮的腫瘤細胞復蘇并擴增，確保腫瘤細胞的活力和良好的生長狀態(tài)
⑵ 計算細胞接種量
根據經驗，一般鼠源腫瘤細胞接種2～100萬/只，而人源腫瘤細胞則需要200-1000萬/只以
上。當然最好結合文獻來確定細胞接種量，在找不到相關資料的情況下，最高就用到1000
萬/0.1ml，不可再高（因為細胞懸液已達飽和狀態(tài)）。并且提前計算確定細胞數(shù)量，一般注射40只小鼠，至少需要準備50只小鼠的細胞量。
⑶ 準備裸鼠
一般選擇5-6W裸鼠，小于4W動物可能不耐受而過早死亡，大于6W免疫力會增強，不
易成瘤；
每批實驗只用同一性別動物，通常雌雄均可，但是根據研究的腫瘤類型及腫瘤細胞系選擇（乳
腺癌等要選擇雌性，前列腺癌等要選擇雄性）
⑷ 操作步驟（請觀看視頻）
① 接種時選擇好部位進針，建議接種前酒精棉球擦拭消毒進針位置；
② 向前方穿行，注射前針頭稍微動一動，能動說明在皮下，否則可能在皮內或者肌肉內；
③ 針頭在皮下走一段再注射，速度不可太快，一般體積為100-200μL（PBS或者無血清培養(yǎng)基稀釋細胞，若不易成瘤可添加matrigel促進成瘤），可看見明顯的鼓包；
④ 接種點離進針點盡量較遠，減少漏液和污染的可能；
⑤ 注射完畢后，緩慢退出針頭，盡量避免漏液；
⑥ 細胞需一直置于冰上，使細胞處于比較低的代謝狀態(tài)，一般2h之內不會有問題。
下面為皮下荷瘤視頻（包括各個部位的注射手法）：
視頻
第三部分：后續(xù)實驗安排
⑴ 分組：一般來說皮下荷瘤主要用于抗腫瘤藥物的檢測，因此我們一般分為對照組，陽性藥物組，低劑量、中劑量及高劑量藥物組等；
⑵ 數(shù)量：荷瘤時每組不少于10只，考慮到小鼠成瘤率和死亡原因，最終實驗應至少可以獲取6個有效數(shù)據；
⑶ 給藥時間：一般接種7-10天后便可看到腫瘤長起，便可分組實驗（鼠源細胞系會更快）；
⑷ 人道終點：動物倫理學規(guī)定，小鼠腫瘤重量不可超過小鼠體重10%，平均腫瘤直徑
不超過20mm，并且如果出現(xiàn)潰爛，造成感染或壞死時，應該中止實驗且對動物施行安樂死。
補充正常免疫小鼠的荷瘤
基本步驟與裸鼠荷瘤一致，只是比較繁瑣的是，由于野生型小鼠有毛發(fā)，所以需要剃毛（如
上圖Balb/c小白鼠腹股溝皮下荷瘤鼠源結腸癌CT26）
第四部分： 皮下荷瘤的幾點問答
⑴ 瘤子長不出來是怎么回事？
一方面可能是細胞狀態(tài)差，活力不好，或是腫瘤細胞不易成瘤，需加入Matrigel輔助或增大接種量或更換細胞系；一方面可能是小鼠周齡太大，或小鼠免疫排斥，建議更換免疫缺陷程度更大的小鼠（Nod-scid小鼠，NOG小鼠＞ Nude裸鼠）
⑵ 小鼠瘤子長起來又消失？
腫瘤塊先縮小，后變大很常見，很可能是炎癥反應，腫瘤細胞被小鼠自身吸收，繼續(xù)觀察腫瘤細胞吸收之后是否經過幾周還能長出來，長不起來建議換鼠。
⑶ 均一性很差，腫瘤體積差距較大？
如果荷瘤分組發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤體積差距很大，這可能跟小鼠周齡及接種細胞量不一致導致，建議重新做實驗分組。
⑷ 是否可以在一只小鼠進行多個點荷瘤？
不可以，一只老鼠就只能接種一個點。因為一個老鼠身上有多個腫瘤塊的情況下，可能會相互影響。
⑸ 是否應用免疫抑制劑加速腫瘤生長？
如果裸鼠荷瘤不生長，可以參考文獻，用免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺（抑制裸鼠NK細胞活性）
促進生長；不過最好不要為了縮短造模周期來加速生長，因為可能會造成潰爛，這樣就不得
不中止實驗。所以一般情況下，應盡量符合細胞系本身的生長特性，不應過多地人為的干擾。
皮下荷瘤實驗介紹就到此結束了，原來看似簡單的實驗卻有多種不可忽視的因素需要考慮。
簡單回顧一下，皮下荷瘤模型中細胞系和小鼠品系是最需要考慮的兩大因素，切記一定要多
查閱文獻并結合預實驗，進而找到最合適的皮下腫瘤模型。
