提起細胞體外培養(yǎng)實驗，每個經(jīng)歷過的實驗者都會有這樣的領(lǐng)悟吧，
細胞虐我千百遍，我待細胞如初戀。
明明小心翼翼的操作，
細胞總會莫名其妙的被污染了！
莫名其妙的掛掉啦！
到底怎么回事呢？
其實造成細胞污染的因素不單單是微生物，培養(yǎng)環(huán)境中所摻雜的物質(zhì)也可能會影響細胞的生長。水是細胞賴以生存的主要環(huán)境，營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物都必須溶解在水中，才能為細胞吸收和排泄。對于體外培養(yǎng)的細胞來說，水是所有細胞培養(yǎng)液和試劑中最簡單、但也是最重要的組分。所以，細胞培養(yǎng)對水的質(zhì)量要求較高，培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導致細胞死亡。
水中的雜質(zhì)對水質(zhì)有不同影響：
1.離子——平衡滲透壓；一些重金屬 (Cadmium)對細胞毒害大，即便劑量很低 (< 0.1 ppb)；
2.微生物——污染，改變微環(huán)境如pH，影響增殖，死后釋放內(nèi)毒素等；
3.內(nèi)毒素——改變細胞外形、活化細胞、促進或抑制細胞分裂、影響細胞附著等；
4.有機物——影響細胞的生長狀態(tài)。
水質(zhì)評價常用的指標：
1. 電阻率（electrical resistivity）
衡量實驗室用水導電性能的指標，單位為MΩ•cm，隨著水內(nèi)無機離子的減少電阻數(shù)值逐漸變大。
2. 異體菌落數(shù)（Heterotrophic bacteria count，HBC）
衡量實驗室用水微生物的指標，單位為cfu/mL。
3. 有機物（Total Organic Carbon ，TOC）
水中碳的濃度，反映水中可氧化的有機化合物的含量，可間接反映出水中細菌和內(nèi)毒素含量的高低。單位為ug/L或ppb。
4. 內(nèi)毒素（Endotoxin）
革蘭氏陰性細菌的脂多糖細胞壁碎片，又稱之為“熱原”，單位EU/mL。
參考國際標準化組織的實驗室純水規(guī)范ISO3696，美國CLSI和ASTM D1193的試劑純水規(guī)范，我國GBT6682和GBT 30301的試驗用水指導，《實驗細胞資源的描述標準與管理規(guī)范》用水指導，結(jié)合多年的實驗操作經(jīng)驗，總結(jié)出細胞培養(yǎng)用水對水質(zhì)的要求。
細胞培養(yǎng)對水質(zhì)的要求：
1.一定要無菌：HBC < 0.01 cfu/mL
2.無蛋白及核酸酶和內(nèi)毒素：無內(nèi)毒素或無熱源<0.03EU/mL
3.阻礙細胞生長的有機物含量要低：TOC <5 ppb
4.去除離子含量：電阻率≥18 MΩ•cm(@25℃)
細胞體外培養(yǎng)用水中純水機的配置要求
細胞培養(yǎng)過程中，各種培養(yǎng)液和試劑的配制用水均需要經(jīng)過嚴格的純化處理，不含離子和其他的雜質(zhì)，即使是儲存試劑的玻璃器皿，在自來水沖洗過后也應(yīng)用超純水漂洗三次以上。目前，市場上供應(yīng)的純水裝置種類較多，比如自來水進水同時制備二級純水和超純水的上海樂楓Genie一體化純水裝置，可以由自來水進水通過預處理柱P Pack、反滲透柱RO Pack及EDI（連續(xù)電流電去離子）模塊等純化后達到二級純水，儲存于水箱中以滿足日常的清洗應(yīng)用；水箱中的水再經(jīng)過U Pack超純化柱去離子，紫外燈照射殺菌并降低有機物含量，最后經(jīng)終端濾器RephiBio過濾，以獲得無菌、無熱源、無核酸酶的超純水。
Genie G 水路圖
要想達到細胞培養(yǎng)用水的水質(zhì)要求，純水機的配置非常關(guān)鍵，帶有消毒模塊的純水水箱、終端過濾器、取水水質(zhì)的實時監(jiān)測等配置都關(guān)系著產(chǎn)水水質(zhì)是否達標。
純水的儲存對保持純水的質(zhì)量是至關(guān)重要的，由于周圍環(huán)境和空氣中的二氧化碳更容易使水污染改變其pH，所以儲存水的容器要盡量密封，避免和外界過多接觸，抑制微生物生長。如Genie純水設(shè)備可以提供的純水水箱帶有紫外消毒模塊和去除二氧化碳的過濾器，能夠最大限度的保證水箱內(nèi)的純水水質(zhì)。
水箱空氣過濾器（含CO2吸附劑） 200/350L 水箱空氣過濾器
主控屏顯示水箱水循環(huán)狀態(tài)
終端濾器可用于去除純水中特定類型的污染物，滿足不同實驗的應(yīng)用需求。對于細胞體外培養(yǎng)可以選用RephiBio Filter 純水終端過濾器，安裝在樂楓超純水系統(tǒng)的出水口，可有效去除水中的熱原（內(nèi)毒素）、核酸酶、細菌等雜質(zhì)，制備符合細胞培養(yǎng)用水要求的超純水（無熱原、無DNase、無RNase、無菌）。
對于超純水而言需要格外注意終端水質(zhì)的TOC、電阻率、細菌和內(nèi)毒素的含量，必須做到即取即用，因此取水的遠程監(jiān)控和水質(zhì)實時監(jiān)測就顯得尤為重要。目前已有廠家可以提供與手柄通過無線連接的實驗室純水機（如上面提到的Genie），將水機和取水手柄分別放在潔凈間的內(nèi)外，通過無線控制取水手柄達到超純水的取用和實時檢測水的電阻率和TOC數(shù)值，非常適合無菌環(huán)境下的操作，最大限度減少污染。
| 無線 · 自由 |  |
|
|
|
手柄觸屏信息
系統(tǒng)運行狀態(tài)：待機，泄壓，循環(huán)，產(chǎn)水 水箱液位：0%或者L 純水（超純水）水質(zhì)參數(shù)：電阻率、TOC、溫度 |
|
終 端 水 質(zhì)
實 時 監(jiān) 測 |
結(jié)合上述用水要求，為大家推薦兩款制備超純水的水機，Genie G一體化純水儀和Genie PURIST 超純水儀。
|
Genie G一體化純水儀 以自來水為進水制備超純水和 EDI 二級純水 |
性能指標
|
|
| |
|
Genie PURIST 超純水儀 以純水（EDI 純水，RO 水或蒸餾水等）為進水，制備實驗室超純水。 |
性能指標
|
|
|
【注意事項】
1.超純水應(yīng)當注意使用時間，最好應(yīng)該“即取即用”。防止超純水吸收外界的雜質(zhì)導致水質(zhì)下降。
2.在合適的環(huán)境使用超純水。環(huán)境中的VOC（揮發(fā)性有機物），細菌等都會影響細胞培養(yǎng)。
3.培養(yǎng)細胞的容器應(yīng)當潔凈無污染。
4.配制離散細胞用的消化液和細胞洗滌液時，宜采用鈣、鎂離子含量低的緩沖液，緩沖液用水可以選用裝配樂楓低鎂型純化柱的純水機，避免鈣、鎂離子促使細胞凝聚作用的產(chǎn)生。
不同細胞體外培養(yǎng)用水選擇指南
細胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細胞培養(yǎng)的整個流程中實驗用水貫穿每一個環(huán)節(jié)：
1.取材：組織的清洗和灌注試劑用水，如PBS緩沖液、Hanks液的配制；
2.原代培養(yǎng)：1640、DMEM等培養(yǎng)基用水，明膠等支持物的配制，添加藥物、檢測試劑的配制；
3.傳代培養(yǎng)：胰酶等消化液的配制；
4.凍存：細胞凍存液DMSO的配制。
細胞體外培養(yǎng)的細胞類型一般分為動物細胞培養(yǎng)、植物細胞培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)，其中最難的是動物細胞的培養(yǎng)。動物細胞的培養(yǎng)除了需要無菌、溫度、氣體、滲透壓、pH等基本條件，它還需要血清、支持物等特殊物質(zhì)，其中原代細胞的培養(yǎng)是最難的。植物細胞的培養(yǎng)需要光照和激素，而且培養(yǎng)條件和培養(yǎng)技術(shù)比較成熟。微生物培養(yǎng)多為單細胞生物，微生物人工培養(yǎng)的條件比動植物細胞簡單得多，蛋白胨、麥芽汁、酵母膏等天然培養(yǎng)基即可滿足微生物的營養(yǎng)要求，其中厭氧微生物培養(yǎng)比好氧微生物復雜，需要維持CO2等非氧惰性氣體的濃度。
由于細胞的種類和培養(yǎng)條件不同，對培養(yǎng)環(huán)境中雜質(zhì)的含量要求也不同，那么配制培養(yǎng)基或試劑用水的選擇大有講究，不同細胞體外培養(yǎng)用水的指標如下：
細胞體外培養(yǎng)用水選擇
|
細胞類型 |
純水等級 |
電阻率 (MΩ·cm) |
TOC (ppb) |
微生物 (cfu/mL) |
內(nèi)毒素(Eu/mL） |
核酸酶 (pg/mL) |
|
動物細胞 |
超純水 |
>18 |
<10 |
<1 |
<0.002 |
ND |
|
植物細胞 |
超純水 |
>18 |
<10 |
<1 |
<0.002 |
ND |
|
微生物 |
實驗室Ⅱ級純水 |
>10 |
<50 |
<1 |
NA |
NA |
從上表可以看出，動物細胞和植物細胞的培養(yǎng)對去除內(nèi)毒素和核酸酶的要求很高，用于這兩類細胞培養(yǎng)可以選擇商品化的細胞培養(yǎng)用水，另外去除純水中的內(nèi)毒素和核酸酶可以通過在純水機的取水口安裝終端濾器達到。
各種細胞培養(yǎng)用水的比較
|
細胞培養(yǎng)用水 |
制備方法 |
優(yōu)點 |
缺點 |
|
商品化細胞培養(yǎng)用水 |
純水或超純水進行多效蒸餾制成，嚴格控制熱源、無菌、內(nèi)毒素、pH、滲透壓等指標 |
水質(zhì)標準程度化高，可保證實驗結(jié)果的重復性 |
價格昂貴 |
|
DEPC水 |
DEPC處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水，無RNase、DNAase和proteinase。 |
完全去除核酸酶 |
價格昂貴，未去除內(nèi)毒素 |
|
終端濾器過濾超純水 |
采用0.22µm的過濾膜，可有效去除水中的熱原（內(nèi)毒素）、核酸酶、細菌等雜質(zhì)。 |
性價比高，供水量大 |
對取水環(huán)境要求高 |
樂楓 RephiBio 終端過濾器采用0.22µm帶正電荷的雙層尼龍66過濾膜，可制備符合生物領(lǐng)域應(yīng)用要求的超純水（無熱原、無DNase、無RNase、無菌），純水中內(nèi)毒素含量低于0.001 Eu/mL，核酸酶的含量低于可檢測范圍，微生物的含量低于0.1 cfu/mL，可以滿足動物細胞和植物細胞的需求。
Tips: 通常情況下樂楓RephiBio 終端過濾器的更換周期為3 個月，以達到最佳使用效果。
