新的基因編輯領(lǐng)域突破口—表觀遺傳調(diào)控
幾十年來，DNA一直被認(rèn)為是決定生命遺傳信息的核心物質(zhì)，但是近些年不斷的研究表明，生命遺傳信息從來就不是基因所能完全決定的，比如科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，可以在不影響DNA序列的情況下改變基因組的修飾，這種改變不僅影響個(gè)體的發(fā)育，而且還可遺傳給后代。如腫瘤等多種疾病并非僅由基因突變而引起，且與DNA和組蛋白修飾等改變而引起的基因異常表達(dá)密切相關(guān)，這就是我們今天要分享的一個(gè)新領(lǐng)域——表觀遺傳學(xué)。隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，目前不僅可以在DNA水平高效編輯校對(duì)，同時(shí)也可在不改變基因序列的情況下對(duì)基因進(jìn)行操縱，進(jìn)一步達(dá)到相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控目的，成為了精準(zhǔn)醫(yī)療的研究熱點(diǎn)。
何為表觀遺傳學(xué)？
遺傳學(xué)是指基于基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如基因突變、基因丟失等；而表觀遺傳學(xué)則是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化等。2018年發(fā)表在國際知名期刊NEJM（The new England journal of medicine）重磅綜述中提到，表觀遺傳學(xué)主要包括四大類[1]：
▼ DNA甲基化：它是5'端核苷酸胞嘧啶的共價(jià)修飾，通常與基因沉默有關(guān)，是表觀遺傳信息的最清晰的例子；
▼ 核心組蛋白翻譯后修飾：如乙�；谆�，磷酸化，泛素化等。每種修飾都與基因活性、基因沉默或活性與非活性基因區(qū)域之間的絕緣有關(guān)；
▼ 高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)：包括通過染色體構(gòu)象捕獲方法揭示的環(huán)組織（即用于分析細(xì)胞中染色質(zhì)的高階組織的技術(shù)）；有組織的染色質(zhì)賴氨酸（K）修飾（LOCKs），和涉及多基因區(qū)域的核區(qū)域的核層結(jié)構(gòu)域（LAD）。
▼ 非編碼RNA：如常見的siRNA,piRNA,miRNA及長非編碼RNA都屬于表觀遺傳的范疇。
大量研究表明疾病的發(fā)生與表觀遺傳學(xué)密切相關(guān)，癌癥是常見表觀遺傳疾病的范例。例如甲基化變異性的增加，與白血病和淋巴瘤中侵襲性更強(qiáng)有關(guān)，在造血系統(tǒng)腫瘤的結(jié)局預(yù)測中也有類似的觀察結(jié)果，慢性淋巴細(xì)胞白血病顯示出更高的內(nèi)部甲基化變異性。這種表觀遺傳變化，特別是表觀遺傳標(biāo)記的變異性，可能是有價(jià)值的、診斷和預(yù)后癌癥的工具。如下圖為正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在表觀遺傳上的對(duì)比：
圖1. 表觀遺傳在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的變化（來源NEJM）
基因編輯如何在表觀基因組操控？
基因編輯工具的迅速發(fā)展使得在天然染色質(zhì)環(huán)境中有針對(duì)性地進(jìn)行表觀基因組編輯和轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為可能，特別是CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展。
優(yōu)勢：能夠調(diào)控基因的表達(dá)而不會(huì)造成永久性的DNA損傷，因而不會(huì)產(chǎn)生有害突變和脫靶效應(yīng)；并且表觀遺傳療法可以通過同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)基因活性來提供更好的治療效果，彌補(bǔ)基因治療存在的不足。
治療原理：目前，表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的設(shè)計(jì)主要基于核酸酶的結(jié)合運(yùn)用，其中以工程化缺陷型核酸酶（dCas9）的結(jié)合最為有效[2]。dCas9是Cas9蛋白的突變體，即Cas9蛋白的RuvC1和HNA兩個(gè)核酸酶活性區(qū)域同時(shí)發(fā)生突變。因此，dCas9蛋白的內(nèi)切酶活性完全消失，只保留由gRNA引導(dǎo)進(jìn)入基因組的能力。
圖2. dCas9示意圖[2]
CRIPSR-dCas9系統(tǒng)提供了一個(gè)研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控和進(jìn)行表觀基因組編輯的平臺(tái)，其設(shè)計(jì)原理在于把各種表觀調(diào)控效應(yīng)器融合到dCas9上，通過核酸酶的靶向并結(jié)合目標(biāo)DNA的特性實(shí)現(xiàn)特定基因組位點(diǎn)上表觀基因組的編輯。這些反式調(diào)控結(jié)構(gòu)域和蛋白是通過向啟動(dòng)子區(qū)域的dCas9靶向位點(diǎn)阻礙RNA聚合酶的結(jié)合或募集內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物來發(fā)揮作用的。以下就是它的兩類主要作用模式：
第一類：dCas9融合轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄原件，通過招募轉(zhuǎn)錄因子或修飾因子起到調(diào)控作用。以下便是常用的一些基礎(chǔ)原件：
▼ 常用的抑制因子：dCas9- KRAB [3-4] 。在這個(gè)系統(tǒng)中，dCas9與Kox1的轉(zhuǎn)錄阻遏物結(jié)構(gòu)域KRAB（Kruppel-associated box）融合，這種增強(qiáng)的CRISPRi系統(tǒng)依靠KRAB招募各種各樣的組蛋白修飾因子，通過形成異染色質(zhì)的方式可逆地抑制基因表達(dá)。
▼ 常用的激活因子：dCas9-VP64[5-6]。VP64是一種RNA結(jié)合蛋白，可以與轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而提高基因的表達(dá)水平。
▼ 除了這些因子之外，dCas9-VPR[7]和dCas9-TV[8]是比dCas9-VP64更有效的轉(zhuǎn)錄激活劑。
第二類：dCas9與表觀遺傳修飾酶來進(jìn)行融合，直接催化DNA或者組蛋白的表觀修飾，調(diào)控基因的表達(dá)。
dCas9-DNMT3A已被證實(shí)可使靶向啟動(dòng)子上的DNA瞬時(shí)甲基化[9]，從而抑制基因的表達(dá)。相比之下，使用dCas9-TET1則可實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子的快速和瞬時(shí)DNA去甲基化，誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)上調(diào)[9-10]。此外，通過dCas9-PRDM9和dCas9 -DOT1L可以實(shí)現(xiàn)組蛋白穩(wěn)定的甲基化，以重新啟動(dòng)表觀遺傳相關(guān)沉默基因的表達(dá)[11]。目前也有研究報(bào)道通過dCas9-LSD1誘導(dǎo)增強(qiáng)子的組蛋白脫甲基化，可下調(diào)靶基因的表達(dá)[12]。通過使用dCas9-P300[13]和dCas9-HDAC3[14]，在靶向增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域可實(shí)現(xiàn)組蛋白瞬時(shí)高效的乙�；兔撘阴；�，調(diào)控基因的表達(dá)。各種調(diào)控效應(yīng)器同dCas9的結(jié)合極大地?cái)U(kuò)展了CRISPR在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀基因組編輯的應(yīng)用范圍，而相關(guān)研究也表明核酸酶的表觀基因組編輯具有極高的安全性和特異性，并且沒有明顯的脫靶效應(yīng)[3],[15]，為體內(nèi)表觀基因修飾和治療奠定了基礎(chǔ)。
細(xì)心的讀者可能注意到了，CRISPR介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控與我們之前介紹過的單堿基編輯工具也是有一定的相同之處的。單堿基編輯系統(tǒng)和表觀遺傳調(diào)控系統(tǒng)都是利用了缺陷型的Cas9蛋白（前者是只產(chǎn)生nick而不產(chǎn)生DSB的nCas9，后者是完全失去內(nèi)切酶活性的dCas9），而且兩者都是通過融合蛋白來起到工作效果（前者是融合堿基編輯蛋白，后者是融合激活因子或抑制因子）。下圖是一個(gè)單堿基編輯與表觀基因組編輯的示意圖，讀者們可以感受一下其中的奧妙。
圖3. 單堿基編輯與表觀基因組編輯示意
在基因治療上的研究進(jìn)展
其實(shí)，基因組表觀遺傳修飾的異常與許多疾病的發(fā)生與發(fā)展息息相關(guān)，如生活中常見的代謝紊亂、心血管疾病和癌癥等等�；诘鞍拙幋a的基因研究是不足以解釋這一類疾病的發(fā)生機(jī)理的，這些疾病的發(fā)病機(jī)制主要是基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳修飾改變的可逆性為治療這類疾病提供了新的希望�；蚨c(diǎn)修飾技術(shù)的發(fā)展更為其精準(zhǔn)治療增加了可能。
目前利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳定點(diǎn)修飾技術(shù)在體內(nèi)治療表觀遺傳異常引起疾病的研究還屈指可數(shù)。接下來小編就帶大家回顧一下現(xiàn)有的基因編輯結(jié)合表觀遺傳治療的代表工作。
1. 常見體細(xì)胞遺傳疾病
▼ 致病機(jī)理：體細(xì)胞中由于遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病。
▼ 代表工作：2017年，一項(xiàng)研究采用了一種gRNA融合MS2-P65-HSF1（MPH）轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物的策略，將截短的gRNA（dgRNA）和MPH包裝到兩個(gè)單獨(dú)的AAV載體中，共同遞送到表達(dá)dCas9的轉(zhuǎn)基因小鼠中。通過靶向激活相應(yīng)的功能性基因成功地修復(fù)了I型糖尿病、急性腎損傷和肌營養(yǎng)不良的疾病表型[16]。
圖4. 通過CRISPR介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控激活體內(nèi)靶基因進(jìn)行遺傳疾病治療[16]
2. 神經(jīng)系統(tǒng)疾病
▼ 致病機(jī)理：神經(jīng)細(xì)胞中由于遺傳缺陷導(dǎo)致的疾病
▼ 代表工作：同時(shí)另一項(xiàng)突破性的工作則使用一種SunTag（dCas9-10xGCN4）系統(tǒng)融合多個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)錄激活蛋白（p65-HSF1），構(gòu)建了一種Cre依賴性的SunTag-p65-HSF1（SPH）轉(zhuǎn)基因小鼠模型。使用AAV8將Cre和sgRNAs遞送到SPH轉(zhuǎn)基因小鼠中，通過激活內(nèi)源性神經(jīng)源性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，在小鼠體內(nèi)成功地實(shí)現(xiàn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為功能性的神經(jīng)元[17]。這一研究表明，在不需要使用外源重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子的前提下，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控的CRISPR系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞的重編程或不同細(xì)胞類型之間的轉(zhuǎn)分化，為體外細(xì)胞基因治療遺傳疾病提供了新的策略。
圖5. Cre誘導(dǎo)的dCas9小鼠[21]
3. 單倍體劑量不足引起的疾病
▼ 致病機(jī)理：單倍劑量不足(haploinsufficiency )指一個(gè)等位基因突變后，另一個(gè)等位基因能正常表達(dá)，但這只有正常水平50%的蛋白質(zhì)不足以維持細(xì)胞正常的生理功能。
▼ 代表工作：近日，Science在線發(fā)表了一篇使用CRISPRa系統(tǒng)在小鼠中成功修復(fù)一種因單倍劑量不足引起的肥胖。研究人員通過AAV在SIM1基因或MC4R基因部分功能喪失的小鼠腦部遞送dCas9-vp64和sgRNA的方式成功激活了SIM1或MC4R蛋白的表達(dá)，成功抑制了肥胖的表型[18]。這一策略給罹患單倍體劑量不足引起的疾病患者帶來轉(zhuǎn)機(jī)。
圖6. 通過CRISPRa治療單倍體劑量不足相關(guān)疾病[18]
4. 異常甲基化引起的疾病
▼ 致病機(jī)理：基因中CpG島中的5' C經(jīng)常突變引起高甲基化、羥甲基化等修飾，研究表明這些異常修飾會(huì)影響基因的表達(dá)調(diào)控，最終引起疾病[19]。
▼ 代表工作：脆性X綜合征（Fragile X syndrome, FXS）就是一種由FMR1基因5' UTR 區(qū)中CGG三核甘酸重復(fù)序列擴(kuò)增突變并高甲基化，使FMR基因沉默而導(dǎo)致的疾病。最近的一項(xiàng)研究通過利用dCas9融合Tet甲基胞嘧啶雙加氧酶1（Tet methylcytosine dioxygenase 1, Tet1）轉(zhuǎn)染FXS iPSCs 細(xì)胞系，成功靶向誘導(dǎo)FMR基因5' UTR CpG島去甲基化，為這些因異常甲基化引起的疾病的治療奠定了基礎(chǔ)[20]。
圖7. 脆性X綜合征相關(guān)疾病的表觀遺傳治療[20]
怎么樣，這次的公眾號(hào)是不是讓大家大開眼界呢？相信通過這四期的公眾號(hào)，大家已經(jīng)對(duì)基因編輯在疾病治療中的研究應(yīng)用有了較為系統(tǒng)的了解，不過“路漫漫其修遠(yuǎn)兮”，從實(shí)驗(yàn)室走到臨床還有較為漫長的距離要走。但是大量的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)給我們看到了未來疾病治療的新曙光，相信終有一天，基因編輯治療的大時(shí)代終會(huì)到來。
參考文獻(xiàn)：（向下滑動(dòng)查看）
[1]Feinberg AP. The Key Role of Epigenetics in Human Disease Prevention and Mitigation. N Engl J Med. 2018, 378(14): 1323-1334.
[2]Brocken DJW, Tark-Dame M, Dame RT. dCas9: A Versatile Tool for Epigenome Editing. Curr Issues Mol Biol. 2018, 26:15-32.
[3]Thakore PI, D'Ippolito AM, Song L, Safi A, Shivakumar NK, Kabadi AM, Reddy TE, Crawford GE, Gers-bach CA. Highly specific epigenome editing by CRISPRCas9 repressors for silencing of distal regulatory ele-ments. Nat Methods, 2015, 12: 1143-1149.
[4]Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, Lim WA, Weissman JS, Qi LS. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of tran-scription in eukaryotes. Cell, 2013, 154(2): 442-451.
[5]Maeder ML, Linder SJ, Cascio VM, Fu Y, Ho QH, Joung JK. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nat Methods, 2013, 10(10): 977-979.
[6]Perez-Pinera P, Kocak DD, Vockley CM, Adler AF, Kabadi AM, Polstein LR, Thakore PI, Glass KA, Oust-erout DG, Leong KW, Guilak F, Crawford GE, Reddy TE, Gersbach CA. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9- based transcription factors. Nat Methods, 2013, 10(10): 973-976.
[7]Chavez A, Scheiman J, Vora S, Pruitt BW, Tuttle M, P R Iyer E, Lin S, Kiani S, Guzman CD, Wiegand DJ, Ter-Ovanesyan D, Braff JL, Davidsohn N, Housden BE, Perrimon N, Weiss R, Aach J, Collins JJ, Church GM. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nat Methods, 2015, 12(4): 326-328.
[8]Li Z, Zhang D, Xiong X, Yan B, Xie W, Sheen J, Li JF. A potent Cas9-derived gene activator for plant and mammalian cells. Nat Plants, 2017, 3(12): 930-936.
[9]Liu XS, Wu H, Ji X, Stelzer Y, Wu X, Czauderna S, Shu J, Dadon D, Young RA, Jaenisch R. Editing DNA methylation in the mammalian genome. Cell, 2016, 167(1): 233-247.
[10]Liu P, Chen M, Liu Y, Qi LS, Ding S. CRISPR-based chromatin remodeling of the endogenous Oct4 or Sox2 locus enables reprogramming to pluripotency. Cell Stem Cell, 2018, 22(2): 252-261.
[11]Cano-Rodriguez D, Gjaltema RA, Jilderda LJ, Jellema P, Dokter-Fokkens J, Ruiters MH, Rots MG. Writing of H3K4Me3 overcomes epigenetic silencing in a sustained but context-dependent manner. Nat Commun, 2016, 7: 12284.
[12]Kearns NA, Pham H, Tabak B, Genga RM, Silverstein NJ, Garber M, Maehr R. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nat Methods, 2015, 12(5): 401-403.
[13]Hilton IB, D'Ippolito AM, Vockley CM, Thakore PI, Crawford GE, Reddy TE, Gersbach CA. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol, 2015, 33(5): 510-517.
[14]Kwon DY, Zhao YT, Lamonica JM, Zhou Z. Locus specific histone deacetylation using a synthetic CRISPRCas9-based HDAC. Nat Commun, 2017, 8: 15315.
[15]Mendenhall EM, Williamson KE, Reyon D, Zou JY, Ram O, Joung JK, Bernstein BE. Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers. Nat Biotechnol, 2013, 31(12): 1133-1136.
[16]Liao HK, Hatanaka F, Araoka T, Reddy P, Wu MZ, Sui Y, Yamauchi T, Sakurai M, O'Keefe DD, Núñez-Delicado E, Guillen P, Campistol JM, Wu CJ, Lu LF, Esteban CR, Izpisua Belmonte JC. In vivo target gene activation via CRISPR/Cas9-mediated trans-epigenetic modulation. Cell, 2017, 171(7): 1495-1507.
[17]Zhou H, Liu J, Zhou C, Gao N, Rao Z, Li H, Hu X, Li C, Yao X, Shen X, Sun Y, Wei Y, Liu F, Ying W, Zhang J, Tang C, Zhang X, Xu H, Shi L, Cheng L, Huang P, Yang H. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nat Neurosci, 2018, 21(3): 40-446.
[18]Matharu N, Rattanasopha S, Tamura S, Maliskova L, Wang Y, Bernard A, Hardin A, Eckalbar WL, Vaisse C, Ahituv N. CRISPR-mediated activation of a promoter or enhancer rescues obesity caused by haploinsufficiency. Science, 2018.
[19]Xu Y, Wu F, Tan L, Kong L, Xiong L, Deng J, Barbera AJ, Zheng L, Zhang H, Huang S, Min J, Nicholson T, Chen T, Xu G, Shi Y, Zhang K, Shi YG. Genome-wide regulation of 5hmC, 5mC, and gene expression by Tet1 hydroxylase in mouse embryonic stem cells. Mol Cell, 2011, 42(4): 451-464.
[20]Hayashi ML, Rao BS, Seo JS, Choi HS, Dolan BM, Choi SY, Chattarji S, Tonegawa S. Rescue of Fragile X Syndrome Neurons by DNA Methylation Editing of the FMR1 Gene. Cell, 2018, 172(5): 979-992.e6.
[21]Lau CH, Suh Y. In vivo epigenome editing and transcriptional modulation using CRISPR technology. Transgenic Res. 2018, 27(6):489-509.
