PCR實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作及步驟

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備;

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在酶的作用下，以P為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

　　重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

　
實(shí)驗(yàn)試劑與器材：

模板DNA、2.5mmol/L 　　q DNA聚合酶(5U/SSR引物

10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O

PCR儀、移液槍、PCR板

實(shí)驗(yàn)步驟：

　　
一、實(shí)驗(yàn)器具與材料：

　　1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

　　2、吸頭：1ml、200μl、20μl

　　3、勻漿管：5ml

　　4、吸頭臺(tái)：放置1ml吸頭的一個(gè)，放置20μl吸頭的一個(gè)

　　5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

　　6、試劑瓶：2個(gè)60ml的棕色試劑瓶(廣口，帶蓋)

　　1個(gè)125ml的白色試劑瓶(放無(wú)水乙醇)

　　7、量筒：50ml、250ml、500ml

　　8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml

　　9、試管架：5ml、1.5ml、20μl

　　10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個(gè)備用，一個(gè)裝無(wú)水乙醇，另一個(gè)裝DEPC水

　　11、鋁制飯盒：4個(gè)

　　12、塑料小飯盒：1個(gè)

　　13、大瓷缸：2個(gè)

　　14、錫泊紙：一卷

　　15、卷紙：2卷

　　16、三角燒瓶：帶蓋，稍大

實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備：

　　
1、塑料制品：(包括槍頭、EP管、勻漿管等)

　　先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個(gè)浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過(guò)夜，然后高壓，再烤干備用，實(shí)驗(yàn)前將槍頭等放入吸頭臺(tái)，再高壓一次(EP管)

2、玻璃制品：泡酸過(guò)夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1‰DEPC過(guò)夜，再烤干)

3、勻漿器：(包括剪刀、鑷子)先洗凈后，再高壓(不需要泡DEPC)

試劑配制：

1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)備用。

2、75%乙醇：用無(wú)水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高壓)

3、異丙醇：放入棕色瓶中

4：放入棕色瓶中

5、瓊脂糖