課堂 | 顯微鏡下的昆蟲記：果蠅發(fā)育調(diào)控可視化

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生命科學最大魅力是紛繁復雜的生物形式，而其中極具挑戰(zhàn)的科題之一是多細胞生物的發(fā)育調(diào)控。

在多細胞個體遺傳調(diào)控研究中，科學家經(jīng)常使用一種看似不起眼但又被廣泛使用的模式動物——果蠅 (Drosophila ontogenesis) ^[1]。

▲ 圖1. 棲息在面團邊緣的果蠅。圖片由德國 UrsulaGönner 提供

遺傳級聯(lián)

遺傳調(diào)控指導受精卵單細胞發(fā)育成復雜多細胞生物體。雖然每個細胞內(nèi)的含有相同的遺傳信息，但微妙的信號調(diào)控不僅會影響細胞本身的發(fā)展，還會影響子代細胞及相鄰細胞的命運。這種發(fā)育級聯(lián)可以用于預測胚胎發(fā)育和生物體的生長。 

從卵細胞受精的那一刻起，一系列時間、空間因子便開始激活特定基因，這些基因最終激活或抑制下游生物體組分產(chǎn)生。遺傳聯(lián)級貫穿整個發(fā)育過程，精準地調(diào)控著個體的發(fā)育^[2]。

發(fā)育生物學研究旨在闡明這些信號，對其進行定性，并在分子層面更好地理解單個細胞如何發(fā)展為復雜多細胞生物體。為此，研究人員經(jīng)常利用各種熒光標記物來標記和鑒定發(fā)育級聯(lián)中的遺傳產(chǎn)物。作為生命活動與光學成像的橋梁，這些熒光標記物通常需要一臺激光共聚焦顯微鏡來觀察^[3]。

光譜分離

借助熒光蛋白表達或免疫熒光標記，在發(fā)育的果蠅胚胎中準確標記多種基因表達物已經(jīng)是廣為使用的手段，但它僅代表成功成像的一半。想要獲得胚胎發(fā)育的完整圖譜，研究人員需要能夠充分分離不同光譜探針的儀器，并且必須具有足夠高的光學分辨率以在適當?shù)慕Y(jié)構(gòu)上對這些標記成像、可視化。

Dianne Duncan 博士是華盛頓大學的生物成像中心負責人。她的興趣之一是果蠅的發(fā)育和遺傳調(diào)控。直到最近，光學和檢測技術(shù)仍然限制著對胚胎中4種熒光標記進行準確成像。光譜重疊導致不能精確地分離熒光團，掃描速度嚴重限制了高分辨率、Z-stacks 多層掃描的使用。此外，由于視場均勻的挑戰(zhàn)，市場上眾多共聚焦顯微鏡的無縫拼接掃描并不盡如人意。

徠卡 SP8 共聚焦平臺具有業(yè)內(nèi)領(lǐng)先的3鏡 (X2Y) 掃描硬件，能夠有效保證不同位置視野的相同光程，實現(xiàn)不同視野均勻掃描，結(jié)合 LAS X Navigator 軟件控制和拼接，帶來多色、高分辨率、高信噪比的大視野成像，實現(xiàn)果蠅胚胎整體多標記成像。

▲ 圖2：果蠅胚胎。Leica SP8進行四熒光通道成像。GFP和免疫標記蛋白決定了胚胎發(fā)育的前后極性。GFP-同源轉(zhuǎn)錄子，綠色螺紋狀；Alexa Fluor568-FTZ因子，紅色；Cy5-pair-rule gene (eve)，紫色；DAPI-細胞核，藍色。圖片由 Dianne Duncan 博士提供

此外，SP8 還配制具有其他優(yōu)化的硬件組合，保證多色成像的前沿需要：

• SP檢測器可以靈活地以 1 nm 精度調(diào)諧檢測帶寬，以實現(xiàn)準確的光譜分離和最佳采集效率；

• 聲光分光器 (AOBS) 用于序列和同時成像的完美激發(fā)；

• 白光激光 (WLL) 的 “白色共聚焦”概念，允許用戶同時使用 470 和 670 nm 之間的任何波長或最多 8 個波長的組合進行多色激發(fā)；

• 混合探測器 (HyD) 具有極低的暗噪聲，其出色的靈敏度允許更低的激發(fā)光強度，從而保持樣品在長時間成像中的生物活性[4]。

用戶之聲

"Leica 光譜檢測器讓我們可以簡單快速地獲得4通道成像，而不會產(chǎn)生串色的困擾。HyD 檢測器有助于生成清晰的圖像，即使深組織中也具有良好的信噪比。"

Dianne Duncan 博士，成像平臺負責人，華盛頓大學（圣路易斯）

參考資料：

1. Taufliegen bekämpfen - 6 Hausmittel gegen Gärfliegen / Mostfliegen

2. Johnston DS and Nüsslen-Vollhard C: “The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo.” Cell 68/2 pp 201-219 (1992)

3. Borlinghaus RT: “The White Confocal” Springer International Publishing (2017); DE: “Konfokale Mikroskopie in Weiß” Springer Spektrum (2016)

4. Borlinghaus RT: “Which Sensor is the Best for Confocal Imaging?” Leica Science Lab