多重數(shù)字PCR技術(shù)介紹

什么是數(shù)字PCR？

數(shù)字PCR是一種新的絕對定量PCR，通過對PCR反應(yīng)物進行有限稀釋，隨后在不同的反應(yīng)腔室里進行PCR擴增，最后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術(shù)。

什么是多重PCR？

多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)；由Chambehian'于1988年首次提出,其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。理論上只要PCR擴增的條件合適,引物對的數(shù)量可以不限,但由于各種條件的限制,實際能夠擴增的引物對數(shù)量是有限的。

什么是多重數(shù)字PCR？

多重數(shù)字PCR是在同一數(shù)字PCR反應(yīng)體系里加上兩對或兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的數(shù)字PCR反應(yīng)。將多重PCR技術(shù)與數(shù)字PCR技術(shù)有機結(jié)合而形成的多重數(shù)字PCR，根據(jù)DNA探針不同熒光度、DNA擴增不同循環(huán)數(shù)及多種標記熒光同時使用，便可大幅提高數(shù)字PCR多重性，多重性可達20-50以上，即同時在一個PCR反應(yīng)單元內(nèi)進行20-50個以上的數(shù)字PCR反應(yīng)。

多重數(shù)字PCR在醫(yī)學檢測中的優(yōu)勢

在數(shù)字PCR中實現(xiàn)多指標的并行檢測能顯著降低檢測成本，獲取更豐富的檢測信息。在一個PCR反應(yīng)中完成基因多個突變位點的檢測，即一個PCR反應(yīng)即可完成一個Panel的檢測，在醫(yī)學領(lǐng)域有著不可替代的優(yōu)勢。

其優(yōu)勢可以簡單概括為以下三點：

1高效性。
在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種核酸片段，或?qū)τ卸鄠�型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。

2系統(tǒng)性。
多重數(shù)字PCR很適宜于成組核酸片段的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌。

3經(jīng)濟簡便性。
多種核酸片段在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出，節(jié)省時間、試劑耗材和經(jīng)費，為臨床提供更多更準確的檢測信息。

多重數(shù)字PCR的檢測類型

數(shù)字PCR的多重檢測主要通過以下兩種方式實現(xiàn)：

1、多個熒光通道。使用多種熒光染料來標記不同的要檢測的靶基因。

2、單波長多強度。使用一種熒光染料，但是擴增結(jié)束時不同的靶基因?qū)��?yīng)的染料的熒光強度不一樣。

多重數(shù)字PCR在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用舉例：

1.多重數(shù)字pcr技術(shù)檢測肺癌EGFR基因突變

來源：Mol Med Rep.2017 Aug;16(2):1157–1166

EGFR基因突變位點的檢測是指導非小細胞肺癌患者臨床用藥的依據(jù)。其中最常見的是21號外顯子L858R突變，19號外顯子缺失以及20號外顯子T790M突變。但是臨床樣本往往是有限的，尤其是液態(tài)活檢樣本，因此多重檢測可以節(jié)省大量檢測樣本及檢測成本。

2，多重數(shù)字pcr技術(shù)在染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用

來源：Analyst.2019 Mar 25;144(7):2239-2247

High-Precision Chromosomal Copy Number Measurement using RainDrop®Digital PCR Application Notes

數(shù)字PCR技術(shù)具有單分子靈敏度和絕對定量的能力，能夠區(qū)分微小差異，很適合用來進行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測。由于胎兒游離DNA占孕婦外周血中游離DNA很小一部分，常規(guī)實驗一對引物探針要想準確分辨胎兒染色體倍數(shù)需要提高足夠多的模板（約41-252ng，胎兒DNA比例10%-4%），這么大量的DNA臨床一般無法提供(1ml血常規(guī)只能獲得1-7ng cfDNA)，這時通過多重數(shù)字PCR設(shè)計40對引物和2個通用探針擴增21號和18號染色體上的各20個片段，就能很好的解決這個問題。結(jié)果顯示以10ng cfDNA作為起始模板，使用多重數(shù)字PCR技術(shù)能夠精準分辨21-三體綜合征。

 

3.探針成本太高，沒關(guān)系我們用染料法也可以做多重數(shù)字PCR

來源：Anal Chem.2013 Dec 3;85(23):11619-27

通過改變擴增產(chǎn)物的長度，或者調(diào)整引物的量，或者改變反應(yīng)的Tm值等條件，可以輕松嘗試多重數(shù)字PCR反應(yīng)。

4.染料法也可以檢測點突變

來源：Anal Chem.2014 Mar 4;86(5):2618-24

染料法也可以檢測SNP點突變，通過在上游引物末端添加一段序列，改變突變型或野生型擴增產(chǎn)物長度即可輕松實現(xiàn)多重檢測。

 

永諾MicroDrop®微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)更適合進行多重PCR檢測

MicroDrop®是由廣東永諾醫(yī)療科技有限公司研發(fā)并投入生產(chǎn)的國產(chǎn)微滴式數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)，是我國首款擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的微滴式數(shù)字PCR儀，20微升體系即可生成10萬微滴，F(xiàn)AM/VIC雙通道熒光檢測，檢測靈敏度低至萬分之一。使用MicroDrop®微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)進行四重PCR反應(yīng)同時檢測EGFR L858R和T790M突變，可以清晰的檢測到16群陽性微滴，提高檢測靈敏度，節(jié)省臨床樣本。

廣州永諾生物

廣州永諾生物科技有限公司成立于2010年，總部位于廣州國際生物島，是一家專注于醫(yī)學科學技術(shù)開發(fā)與服務(wù)、分子診斷產(chǎn)品研發(fā)與生產(chǎn)的高新技術(shù)企業(yè)。公司目前占地面積近6000平方米，碩、博士以上學歷員工占比近40%，已建立包括基因組高通量測序、分子細胞功能實驗、病毒包裝構(gòu)建和動物疾病模型等在內(nèi)的一整套研發(fā)、生產(chǎn)技術(shù)體系平臺。

公司依托先進的技術(shù)力量以及具有競爭優(yōu)勢的人才儲備，建成符合國家標準的SPF級實驗動物中心及常規(guī)分子實驗平臺1000平方米、符合GMP標準的分子診斷試劑及產(chǎn)品車間2500平方米、醫(yī)學檢驗實驗室1000平方米、辦公場所1000平方米。并于2017年獲廣東省衛(wèi)生與計劃生育委員會批準執(zhí)業(yè)第三方醫(yī)學檢驗所—廣州永諾醫(yī)學檢驗所，2018年獲得廣東省科技廳授予的實驗動物使用許可證。

廣東永諾醫(yī)療

廣東永諾醫(yī)療科技有限公司是永諾生物旗下的子公司，永諾生物以“中國智造”為己任，2017年10月永諾生物成功研發(fā)了國內(nèi)首款擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)MicroDrop®并投入生產(chǎn)，是國內(nèi)首款微滴式數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)。目前數(shù)字PCR系統(tǒng)儀器及配套試劑、數(shù)字PCR腫瘤液體活檢試劑盒等正在申報醫(yī)療器械注冊證，能廣泛應(yīng)用于科研、醫(yī)療、出入境檢驗檢疫等領(lǐng)域。

永諾醫(yī)療于2019年5月入駐佛山生命科學園，廠房面積達2500平方米，預(yù)計產(chǎn)能：年產(chǎn)200套儀器。