數(shù)字PCR技術(shù)在DNA甲基化檢測(cè)中的應(yīng)用

DNA甲基化是目前研究最多的表觀遺傳修飾之一，發(fā)生于CpG二核苷酸序列C5位置的胞嘧啶上，多發(fā)生于CpG島上，研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，包括胚胎發(fā)育，轉(zhuǎn)錄，X染色體失活，基因組印跡、染色體穩(wěn)定性等。

許多研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在一系列的疾�。ㄈ绨┌Y等）起到十分重要的作用。在癌癥患者中，與正常人體相比，DNA甲基化多發(fā)生兩個(gè)變化：1、啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的高甲基化，導(dǎo)致腫瘤抑制基因沉默；2：重復(fù)區(qū)域的低甲基化，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定^1，2。

圖1：DNA甲基化與癌癥的關(guān)系¹

DNA甲基化的改變多發(fā)生于癌癥早期，在某些特定癌癥中，檢測(cè)特異的甲基化標(biāo)志物有助于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)，進(jìn)而大大提高癌癥患者的生存率。目前，美國(guó)國(guó)家癌癥協(xié)會(huì)（ACS）在最近更新的結(jié)直腸癌篩查指南中建議每3年做一次多靶點(diǎn)糞便DNA的甲基化檢測(cè)。因此，急需找到一個(gè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單快捷的方法對(duì)臨床樣本DNA甲基化進(jìn)行檢測(cè)。

微液滴數(shù)字PCR (ddPCR)是近年來(lái)PCR技術(shù)的一項(xiàng)新進(jìn)展，通過(guò)微液滴化，終點(diǎn)PCR和泊松分布，數(shù)字PCR無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)核酸濃度的絕對(duì)定量。與實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（qPCR）對(duì)比，數(shù)字PCR具有靈敏度高，準(zhǔn)確度高、精密度高、重復(fù)性高，對(duì)PCR抑制劑耐受度高的優(yōu)勢(shì)。

目前，Dawne N等人³使用數(shù)字PCR進(jìn)行DNA甲基化的檢測(cè)。結(jié)果顯示，數(shù)字PCR方法可檢出低至0.5%的SNRPN啟動(dòng)子甲基化，其線性R²可達(dá)到0.9903，且兩次完全獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性極強(qiáng)。

 

圖2：ddPCR檢測(cè)DNA甲基化的靈敏度、線性范圍³

（A、B為兩次完全獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）³

使用ddPCR方法檢測(cè)VIM基因啟動(dòng)子DNA甲基化，其最低靈敏度可達(dá)到0.03%，線性R²可達(dá)到0.9998。且將ddPCR結(jié)果與NGS檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，一致性強(qiáng)，所用DNA量更少。

Liesbeth Van Wesenbeeck等人⁴使用ddPCR和qPCR做DNA甲基化線性檢測(cè)時(shí)，圖4對(duì)比結(jié)果顯示，在檢測(cè)低拷貝DNA時(shí)，ddPCR準(zhǔn)確性較qPCR更高。

圖4：ddPCR（左圖）與qPCR（右圖）測(cè)試高拷貝

（1157拷貝/反應(yīng)，上圖）與低拷貝（222拷貝/反應(yīng)，下圖）

DNA甲基化實(shí)測(cè)值與理論值之差與理論值關(guān)系圖⁴

綜上所述，使用ddPCR方法進(jìn)行DNA甲基化分析時(shí)，其靈敏度高，穩(wěn)定性高，準(zhǔn)確性高，可用于檢測(cè)血漿游離DNA、FFPE DNA等多種樣本來(lái)源的DNA的甲基化狀態(tài)。因此，基于ddPCR的甲基化檢測(cè)技術(shù)將來(lái)有潛力應(yīng)用于腫瘤甲基化標(biāo)志物的檢測(cè)中，輔助臨床診斷和治療，應(yīng)用于腫瘤早診和篩查領(lǐng)域。

新羿生物專注于微液滴數(shù)字PCR全鏈條自主研發(fā)，包括芯片、儀器、試劑、軟件等核心產(chǎn)品，目前已申請(qǐng)專利50余項(xiàng)，開(kāi)發(fā)產(chǎn)品數(shù)十項(xiàng)。新羿生物的試劑類產(chǎn)品不僅可以在新羿TD-1數(shù)字PCR平臺(tái)上使用，而且可以在其他商用微液滴數(shù)字PCR平臺(tái)上使用，靈敏度高，特異性好，重復(fù)性高。新羿生物的微液滴數(shù)字PCR技術(shù)在檢測(cè)過(guò)程中全程封閉檢測(cè)，不需轉(zhuǎn)移液滴，可避免交叉污染，方便、準(zhǔn)確、靈敏。

隨著人民生活水平的提高，我國(guó)結(jié)直腸癌(Colorectal Carcinoma, CRC）發(fā)病率逐年升高，現(xiàn)在我國(guó)發(fā)達(dá)地區(qū)CRC已經(jīng)是發(fā)病率居第二位的惡性腫瘤，成為威脅我國(guó)人民健康的一種重大疾病，但是CRC發(fā)展相對(duì)緩慢，可以通過(guò)早期發(fā)現(xiàn)而得到根治及預(yù)防。新羿結(jié)直腸癌甲基化基因檢測(cè)試劑盒采用Methyl-ddPCR技術(shù)，以CRC糞便樣本DNA為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)CRC糞便樣本中多個(gè)基因的甲基化狀態(tài)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，從而輔助臨床早期診斷結(jié)直腸癌。

參考文獻(xiàn):

1. Keith D. Robertson, “DNA methylation and human disease”. Nature Reviews: Genetics. 2005; 6: 597-610.

2. Ernst J. Kuipers, et al. “Colorectal cancer”. Nature Reviews: Disease Primers. 2015; 1: 1-25.

3. Dawne Shelton, et al. “AACR 2014 - Cross Validation of NGS methylated targets using ddPCR”. https://www.researchgate.net/publication/263043581.

4. Liesbeth Van Wesenbeeck, et al. “Droplt digital PCR is an accurate method to assess methylation status on FFPE samples”. Epigenetics. 2018; 13 (3): 207–213.