血漿蛋白結合率的經(jīng)典測定方法之平衡透析法

藥物在血漿中會不同程度地與血漿蛋白結合，其結合的程度能夠影響藥物的體內的吸收、分布、代謝和排泄，進而會影響藥物的藥效學行為。一般來說，藥物在吸收進入血液之后，僅游離的藥物能夠到達作用部位，產(chǎn)生藥理學活性。平衡透析法是基于藥物結合的平衡原理來測定藥物游離濃度最常用的方法，也是研究藥物血漿蛋白結合率的經(jīng)典方法。
研究發(fā)現(xiàn)蛋白質的重要生理和藥理功能都需要有藥物小分子的參與，藥物小分子通過與蛋白質的相互作用可以促進或者抑制蛋白質功能的實現(xiàn)，尤其是藥物與血漿蛋白結合會影響到藥物的生物學活性。因此藥物血漿蛋白結合率的測定對于藥物研發(fā)較為重要。
1、平衡透析法
藥物血漿蛋白結合率是藥物在動物體內重要的藥理學參數(shù)之一，影響著藥物體內游離濃度進而影響藥物的處置過程。高等動物藥物血漿蛋白結合研究已得到長期的發(fā)展。平衡透析法可以測定藥物血漿蛋白結合率，該法是用透析膜將蛋白質溶液與緩沖液分隔開，建立在兩者之間的一種平衡狀態(tài)，只有分子量小的藥物小分子可以通過。透析的動力是擴散壓，擴散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度與膜的厚度、透析的小分子溶質在膜兩邊的濃度梯度及透析溫度等因素有關。平衡透析法能夠直接測出為與蛋白結合的藥物小分子的數(shù)量，這是分析蛋白與小分子物質結合的關鍵，從而能夠求出結合位點數(shù)及結合常數(shù)。
2、血漿蛋白結合率對藥物的作用
各種藥物以一定的比率與血漿蛋白結合之后，在血漿中會同時存在結合型與游離型兩種類型，游離性藥物具有藥物活性。藥物與血漿蛋白結合會成為結合型藥物，暫時失去藥理活性，并且儲存于血液中，起到藥庫的作用，對于藥物作用及其維持時間長短具有重要的意義。一般蛋白結合率高的藥物體內消除慢，作用維持時間長，藥效平穩(wěn)。結合率低的藥物體內消除快，同時作用時間短，藥效有很大的波動。
藥物內源性性化合物也可在血漿蛋白結合部位發(fā)生競爭性置換作用，兩種以上的藥物聯(lián)用時，可相互競爭血漿蛋白的結合部位，結合力強的藥物能從蛋白結合部位上取代結合力弱的藥物，使后者游離型數(shù)量增加，導致藥效和毒性反應亦增強。其影響程度可因后者在體內的分布容積不同而異。一般只有血漿蛋白結合率高，分布容積小，消除慢以及治療指數(shù)低的藥物在臨床上的這種相互作用才有意義。血漿蛋白結合率測定屬于藥代動力學研究內容，美迪西是一家醫(yī)藥研發(fā)外包服務公司，在藥代動力學體外研究方面有豐富的經(jīng)驗，體外研究是指代謝穩(wěn)定性、P450誘導和抑制、代謝途徑研究、代謝產(chǎn)物鑒定等研究項目，涉及的動物有大鼠、小鼠、兔、狗、猴子等。
3、平衡透析法測定血漿蛋白結合率的應用
如有研究者利用平衡透析法測定了羊耳菊提取物中9個成分的血漿蛋白結合率。研究者采用平衡透析法測定提取物中9個成分血漿蛋白結合率，生物樣本用甲醇沉淀蛋白法進行處理，再以葛根素為內標，利用超高效液相色譜-質譜儀串聯(lián)測定血漿及緩沖溶液中的綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、東莨菪苷、1，3-O-二咖啡�；�奎寧酸、3，4-O-二咖啡�；�奎寧酸、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸和4，5-O-二咖啡酰基奎寧酸等9個成分的濃度^[1]。
結果發(fā)現(xiàn)在所研究濃度范圍內，9個成分呈現(xiàn)良好的線性關系(r≥0.999)，準確度、精密度、提取回收率和穩(wěn)定性等均符合生物樣品測定要求，且并無內源性雜質干擾，表明該文所建立的方法穩(wěn)定可靠，可用于羊耳菊藥材中9種成分在人和大鼠血漿中的血漿蛋白結合率測定。9種成分在人和大鼠血漿中的平均蛋白結合率分別在(41.07±0.046)%～(94.95±0.008)%，(37.66±0.043)%～(97.46±0.013)%。結果表明羊耳菊提取物中9個成分在人和大鼠中的血漿蛋白結合率存在差異。
還有研究者采用平衡透析法模擬化合物LS-177在體內與血漿蛋白的結合過程，采用UPLC-MS/MS方法對透析外液和內液中LS-177的含量進行測定，計算LS-177與大鼠、比格犬和人的血漿蛋白結合率。結果發(fā)現(xiàn)所建立的LS-177蛋白結合率測定方法簡便、穩(wěn)定、可靠，LS-177血漿蛋白結合率不具有明顯的濃度依賴性和種屬差異。
平衡透析法在測定藥物血漿蛋白結合率具有操作簡單、溫度易于控制、PH值可調、設備成本低廉等優(yōu)點。但是同時存在達成平衡時間較長、溶液體積會變化，且透析時間過長可能會造成由加熱或代謝引起的被測物質的降解等缺點。因此在利用平衡透析法測定藥物血漿蛋白結合率，或者藥物與蛋白質相互作用時需要與其他的一些方法聯(lián)用，才能獲得更準確的作用信息。
[1]平衡透析法測定羊耳菊提取物中9個成分的血漿蛋白結合率[J].