基因敲除的不簡單-論p53基因的重要性

p53基因位于17號(hào)染色體p13，全長16-20kb，含有11個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄2.8kb的mRNA，編碼一種分子量為43.7KDa的P53蛋白質(zhì)，是一種核內(nèi)磷酸化蛋白。因蛋白條帶出現(xiàn)在Marker所示53KDa處，命名為P53。p53基因是人體一種腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene），具有控制其眾多靶基因的不同集合的功能（圖1），如參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和凋亡、基因擴(kuò)增、DNA重組、DNA修復(fù)等。

圖1  p53控制廣泛和靈活的網(wǎng)絡(luò)^[1]

p53網(wǎng)絡(luò)有各種各樣的調(diào)控因子調(diào)控p53的活動(dòng)，而p53反過來又控制著許多不同的生物學(xué)過程。每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)基因，每條線代表一個(gè)交互反應(yīng)。p53的激活需要多種信號(hào)通路（藍(lán)線），同樣的p53也會(huì)影響多種信號(hào)通路（紅線）。

 

   p53基因與多種腫瘤發(fā)生都有一定相關(guān)性，在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)該基因的突變（圖2）。

圖2  p53在癌癥中的腫瘤抑制作用^[2]

p53蛋白在人類癌癥中具有腫瘤抑制作用。近50%的癌癥類型發(fā)生p53突變。突變型p53等位基因的遺傳可以使人類患上Li-Fraumeni癌癥綜合征。p53失活的小鼠百分百會(huì)發(fā)生癌癥。 

 

    科學(xué)研究中通常采用基因敲除鼠模型來研究基因的功能，模擬疾病的發(fā)生，尋找發(fā)生機(jī)制。那么p53基因敲除小/大鼠后，會(huì)與哪些疾病發(fā)生有關(guān)呢？

 

1.惡性纖維組織肉瘤

通過TALEN技術(shù)構(gòu)建了p53基因敲除大鼠模型（在p53基因外顯2設(shè)計(jì)TALEN 結(jié)合位點(diǎn)（圖3），通過PCR及測序驗(yàn)證，以高陽性率獲得p53基因敲除大鼠模型），p53基因敲除純合子大鼠的腹腔出現(xiàn)惡性纖維組織肉瘤，腫瘤組織累及肝臟、膀胱及胰腺。

圖3  p53基因敲除大鼠TALEN結(jié)合位點(diǎn)^[3]

2.系統(tǒng)性炎癥

對(duì)分離出的Trp53+/+乳腺癌細(xì)胞，通過CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除p53，并將p53-KO組與對(duì)照組的細(xì)胞原位移植到同基因野生型小鼠體內(nèi)，然后檢測移植后小鼠中性粒細(xì)胞的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p53-KO組中性粒細(xì)胞明顯升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞中p53的缺失是癌癥誘發(fā)的全身性中性粒細(xì)胞炎癥的核心驅(qū)動(dòng)事件。

 

圖4 乳腺腫瘤中p53狀態(tài)決定免疫激活^[4]

3.食管鱗癌

p53基因的第1個(gè)內(nèi)含子和第10個(gè)內(nèi)含子序列中各插入一段方向相同的loxp序列，此序列可被Cre重組酶剪切重組，導(dǎo)致體細(xì)胞內(nèi)p53基因第2至10外顯子序列缺失。

具體步驟：利用Cre/loxp系統(tǒng)將p53^flox/flox（B6.129 P 2-Trp53^tm1Brn/J）小鼠（基因型為B6.p53^flox/flox）與ED-L2-Cre^+/-工具鼠（B6.Cg-Tg（ED-L2-cre）267Jkat/Nci）合籠交配，雜交兩代得到KO小鼠和同窩對(duì)照loxp小鼠。建立甲基芐基亞硝胺誘導(dǎo)的KO小鼠食管癌前病變模型。結(jié)果表明，p53基因敲除與食管癌的形成有關(guān)^[5]。

圖5  KO小鼠構(gòu)建流程圖^[5]

 

4.子宮內(nèi)膜漿液性癌

通過Cre-loxp條件性敲除系統(tǒng)，選取Ksp1.3啟動(dòng)子為Cre重組酶的組織特異性位點(diǎn)，特異性敲除小鼠子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞中的Trp53基因?qū)е铝俗訉m內(nèi)膜漿液性癌的發(fā)生。

 

圖6  KO小鼠構(gòu)建流程圖^[6]

 

目前，有關(guān)肺臟、子宮、胃、口腔、舌、前腦等組織中p53基因條件性敲除的小鼠模型已成功建立。p53無疑是研究癌癥疾病模型的明星基因。上述示例可以看出，同樣都是p53基因的敲除，不同的基因編輯小鼠和制備方式、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，卻得到與不同的癌癥有關(guān)的研究結(jié)果。

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參考文獻(xiàn)：

[1] Kastenhuber E R, Lowe S W. Putting p53 in Context[J]. Cell, 2017, 170(6):1062-1078.

[2] https://www.sohu.com/a/314245063_468664?spm=smpc.author.fd-d--1.11.1574

651297832RezZ3Bl

[3] 霍桂桃,楊艷偉,吳曦等. p53基因敲除大鼠模型的構(gòu)建及表型分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2018,34(8):170-174.

[4] Wellenstein M D, Coffelt S B, et al. Loss of p53 triggers WNT-dependent systemic     inflammation to drive breast cancer metastasis.[J]. Nature,2019, 572(7770):538-542.

[5] 許巖巖.食管上皮組織p53敲除小鼠食管癌前病變模型的建立[D]. 鄭州大學(xué), 2018.

[6] 張文靜.子宮內(nèi)膜漿液性癌TP53基因敲除小鼠模型研究[D]. 山東大學(xué), 2016.