熒光定量PCR儀的關(guān)鍵參數(shù)和重要特性

熒光定量PCR儀的關(guān)鍵參數(shù)和重要特性  在選購熒光定量PCR儀時，幾個關(guān)鍵參數(shù)要注意：
   1.儀器的檢測通量（Throughput）
    首先要考慮實(shí)驗室目前需要使用定量PCR儀的頻率。加州大學(xué)舊金山分校癌癥中心的基因組分析設(shè)備負(fù)責(zé)人David Ginzinger檢測過市面上絕大多數(shù)的定量PCR儀。他表示，如果不是大規(guī)模批量使用，比如說主要是用來檢測驗已知基因，那確實(shí)不需要昂貴的高端產(chǎn)品。但是如果是那些需要尋找新藥靶點(diǎn)和疾病標(biāo)記的實(shí)驗室，就需要能容納384孔板、運(yùn)行時間更快的儀器。不過僅有這么一件高通量的儀器是不夠快的，你會發(fā)現(xiàn)樣品制備成為限速的瓶頸。所以高通量的實(shí)驗室往往需要進(jìn)一步的自動化儀器，只要“按一下鈕”，儀器就會自動處理樣品、純化核酸和制備PCR模板。
 
   2.多重擴(kuò)增的能力 
    多重擴(kuò)增越來越熱。實(shí)時定量PCR儀也不能幸免。高端定量PCR儀擁有多個檢測通道，因而儀器就可以檢測同一個樣品槽里多個模板的擴(kuò)增過程。新的LightCycler2.0 有6個檢測通道，比原來多了3個。SmartCyclerⅡ有4個檢測通道。以文庫產(chǎn)品而名滿天下的Stratagene也有一種價格不到Roche的一半、口碑不錯的定量PCR儀Mx3000P，也就是4個檢測通道。不過多重擴(kuò)增并非人人適用，因為它使實(shí)驗復(fù)雜化了。
 
  3．軟件 
     當(dāng)你準(zhǔn)備選擇一臺定量PCR儀，你必須要檢測附帶的軟件。使用方便嗎，是否可以進(jìn)行你所需要的分析，輸出格式有幾種。不過，你需要留意，太容易使用的軟件是不是功能比較簡單而無法進(jìn)行復(fù)雜計算，以前的軟件還需要你做進(jìn)一步分析，新的軟件已經(jīng)可以處理一切了。除了基本功能，部分軟件還可以有更多的功能，比如引物和探針設(shè)計、多重分析設(shè)計、背景校正、數(shù)據(jù)歸一化等等。Roche應(yīng)用科學(xué)部的應(yīng)用和技術(shù)服務(wù)部負(fù)責(zé)人Willian Demyan 就強(qiáng)調(diào)：定量PCR是一個幾何擴(kuò)增的過程，開始時一個拷貝之差，結(jié)果就有幾何數(shù)量級之別。
 
    4.靈活性 
    大規(guī)模繁忙的實(shí)驗室設(shè)備先進(jìn)固然令人羨慕，常規(guī)的實(shí)驗室同樣可以有精彩的選擇�，F(xiàn)在的供應(yīng)商都擁有眾多的技術(shù)專家，不單了解你的目前需要，還非常周到地為你考慮了以后可能的需求變化，比如提供多種可升級配件和模塊。BioRad的MyCycler就可以選擇模塊而升級為實(shí)時定量。ABI的定量PCR儀有多種不同的樣品槽，可以將96孔槽變?yōu)殡p384孔槽而滿足部分高通量的需求。對于剛開始小量做qPCR的實(shí)驗室來說，SmartCyclerⅡ定量PCR儀是一個好選擇，一個基本模塊有16個獨(dú)立控溫樣品槽，可以同時或者前后分別進(jìn)行16個完全獨(dú)立的不同實(shí)驗， “隨機(jī)存取”；當(dāng)實(shí)驗室需要較大規(guī)模實(shí)驗時，可以非常經(jīng)濟(jì)地升級，從1個增加到6個基本模塊，也就是96樣品孔。雖然不能用96孔板，但是當(dāng)一個學(xué)生開始小量實(shí)驗，其他人還可以隨時插進(jìn)去開始自己的獨(dú)立實(shí)驗，而且互不干擾，就是增加了靈活性。對于剛開始只做少量實(shí)驗而且預(yù)算較緊張的實(shí)驗室來說是非常靈活的選擇。
 
    5.不確定性 
   盡管軟件可以做部分修正，購買一臺系統(tǒng)誤差較少的儀器，無需那么多計算修正總比靠計算修正好。Cinzinger 就認(rèn)為，要特別注意儀器樣品孔之間的差異性。除了眾所周知的樣品孔之間的溫度差異，還有樣品孔和檢測探頭之間光程距離、負(fù)責(zé)收發(fā)和傳遞信號的光纖長度的微小差別、透鏡和樣品孔間的距離和角度的微小差別、甚至樣品槽對信號傳遞的影響。Cinzinger在絕大多數(shù)的市售的定量PCR儀做過同樣的測試，他將同樣的樣品和反應(yīng)試劑在儀器的每一孔進(jìn)行實(shí)時擴(kuò)增。很不幸，很多時候，不同樣品孔之間會有不同的結(jié)果。
 
    6.試劑盒的選擇 
    盡管銷售人員會吹噓有出色質(zhì)量控制的試劑盒和解決方案就會得到一至的結(jié)果，但購買現(xiàn)成的試劑盒并不是解決差異性的辦法。認(rèn)真的評估實(shí)驗和分析實(shí)驗才是解決之道。