Orbitrap Exploris™ 480在鑒定測試方面助力文獻(xiàn)研究
今天跟大家分享的是Orbitrap Exploris™ 480的第1篇文獻(xiàn)，作者是來自丹麥哥本哈根大學(xué)的Jesper V. Olsen教授，文中對Exploris 480聯(lián)合FAIMS Pro的性能進(jìn)行了全面測試，包括DDA與DIA鑒定，靈敏度測試，組織樣品測試，磷酸化樣品測試，以及TMT與DIA定量等。
文獻(xiàn)總結(jié)：
- DDA-FAIMS：單個(gè)FAIMS CV電壓，500ng Hela 肽段，21分鐘梯度可鑒定3473個(gè)蛋白；
- DIA-FAIMS：單個(gè)FAIMS CV電壓，500ng Hela 肽段，每分鐘可鑒定2500條unique肽段，配合21分鐘短梯度每天可分析60個(gè)樣品，且每個(gè)樣品定量超過5000個(gè)蛋白；
- 靈敏度測試：5分鐘梯度，5ng Hela肽段中鑒定超過1000個(gè)蛋白；
- 組織特異性蛋白分析：12種大鼠組織樣品中TMT及DIA定量超過10000個(gè)蛋白；
- 快速、靈敏、深度的磷酸化蛋白質(zhì)組。
緊湊型四極桿-Orbitrap質(zhì)譜儀
相比其它二合一的儀器，Exploris 480儀器是一個(gè)更緊湊更穩(wěn)健的平臺(tái)，且更易維護(hù)。該儀器與三合一系列中的Fusion Lumos及Eclipse有相同的離子源、接口，以及用戶界面，因此可使用與三合一相同的前端選配件，包括FAIMS Pro接口以及內(nèi)標(biāo)校正EASY-IC源。同時(shí)，Exploris 480中的主動(dòng)離子傳輸組件、四極桿、獨(dú)立的電荷檢測器以及多級離子通道組件均進(jìn)行了全新的設(shè)計(jì)升級，提升儀器性能（圖1）。
圖1 Orbitrap Exploris™ 480儀器硬件示意圖
DDA-FAIMS深度蛋白鑒定
擴(kuò)大動(dòng)態(tài)范圍
樣品：500ng Hela肽段
梯度：21分鐘（60個(gè)樣品每天）
鑒定結(jié)果：CV電壓在-35V~-80V間，蛋白鑒定數(shù)目均高于不使用FAIMS，其中-75V時(shí)zui高，可鑒定3473個(gè)蛋白，比不使用FAIMS高出38%（圖2A）。
圖2A ：21min梯度，500ng樣品，不同CV電壓時(shí)DDA-FAIMS以及DDA的蛋白鑒定
動(dòng)態(tài)范圍：與不使用FAIMS相比，DDA-FAIMS不僅可覆蓋更多的蛋白，還可覆蓋更深的Hela蛋白豐度分布，即更高的動(dòng)態(tài)范圍（圖2B）。
圖2B：DDA-FAIMS及DDA與Hela深度蛋白組的蛋白豐度分布疊加圖
梯度影響：與不使用FAIMS相比，隨著梯度的縮短，-75V CV時(shí)的優(yōu)勢更加明顯。采用100個(gè)和200個(gè)樣品每天的梯度時(shí)，分別增加41%和48%的蛋白鑒定數(shù)目（圖2C）。由于文中采用的梯度均很短，而CV電壓的切換需要25ms，因此單個(gè)CV電壓條件zui為合適。當(dāng)梯度延長時(shí)，可通過不同CV電壓組合的方式進(jìn)一步提高蛋白組覆蓋。
圖2C：不同梯度時(shí)DDA-FAIMS與DDA的蛋白鑒定對比
DIA-FAIMS進(jìn)一步擴(kuò)大蛋白深度鑒定，增加蛋白定量精度
樣品：500ng Hela肽段
梯度：21分鐘（60個(gè)樣品每天）
鑒定結(jié)果：DIA-FAIMS的zui優(yōu)CV電壓為-45V，可鑒定5138個(gè)蛋白，蛋白與肽段鑒定數(shù)目均高于不使用FAIMS時(shí)（圖3A），每分鐘zui高可鑒定2500條肽段（圖3B）。
圖3A：21min梯度，500ng樣品，不同CV電壓時(shí)DIA-FAIMS以及DIA的蛋白鑒定；B：梯度中不同時(shí)間的肽段鑒定數(shù)目
定量精度：使用FAIMS時(shí)，71%的蛋白豐度在多次重復(fù)間CV值小于20%，54%的蛋白豐度CV值小于10%。而不使用FAIMS時(shí)，只有60%的蛋白豐度在多次重復(fù)間CV小于20%（圖3C）。
圖3C：DIA-FAIMS與DIA的多次重復(fù)蛋白豐度CV對比
極少量樣品時(shí)的靈敏度測試
樣品：5ng Hela肽段
梯度：5分鐘（200個(gè)樣品每天）
DDA結(jié)果：DDA只鑒定到26個(gè)蛋白，DDA-FAIMS實(shí)現(xiàn)10倍提升至281個(gè)蛋白（圖4A）。DDA-FAIMS相比DDA更適用于極少量樣品的分析，這是由于FAIMS可有效去除單價(jià)態(tài)的背景信號（圖4C）。
DIA結(jié)果：DIA可鑒定547個(gè)蛋白，DIA-FAIMS可鑒定超過1000個(gè)蛋白（圖4A），且FAIMS可提升DIA的定量重現(xiàn)性（圖4B）。
圖4A：5min梯度，5ng樣品在不同方法下的蛋白鑒定數(shù)目；B：DIA與DIA-FAIMS方法中重復(fù)間蛋白豐度CV小于20%的蛋白數(shù)目；C：DDA與DDA-FAIMS時(shí)的單價(jià)態(tài)母離子分布對比
組織特異性蛋白定量分析
樣品：來源于12種大鼠組織的酶解肽段（圖5A）
圖5A：大鼠組織特異性圖譜工作流
梯度：21分鐘（60個(gè)樣品每天）
組織特異性蛋白圖譜：每個(gè)組織所含肽段各有不同，從骨骼肌中可鑒定50000條unique肽段，到睪丸組織中可鑒定到100000條肽段代表超過10000個(gè)蛋白（圖5B，C）。該數(shù)據(jù)集含有213000條unique肽段，覆蓋12909個(gè)蛋白編碼基因，可用于進(jìn)一步數(shù)據(jù)挖掘以及作為DIA的譜圖庫。
圖5B：不同組織中的肽段鑒定數(shù)目；C：不同組織中的蛋白鑒定數(shù)目
TMT-11定量：數(shù)據(jù)采集使用Turbo-TMT方法，可在15000分辨率下分析TMT11標(biāo)的樣品。每次實(shí)驗(yàn)代表一只大鼠，均可定量超過8000個(gè)蛋白，總共定量超過10000個(gè)蛋白（圖6A）。
DIA定量：不同組織分別進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，用對應(yīng)組織的譜圖庫進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。蛋白組在不同組織間存在特異性，在睪丸組織中可鑒定超過5000個(gè)蛋白，肌肉組織中能鑒定約2000個(gè)蛋白。合并不同組織結(jié)果可定量超過8000個(gè)蛋白，與TMT的覆蓋率類似（圖6A），且每分鐘可鑒定超過600個(gè)蛋白（圖6B）。
圖6A：組織樣品中DIA與TMT的蛋白及蛋白編碼基因PCG的定量數(shù)目；B：兩種方法每分鐘定量的PCG數(shù)目
生物樣品的重現(xiàn)性分析：分別使用TMT與DIA的數(shù)據(jù)對三個(gè)生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行主成分分析PCA。三個(gè)生物學(xué)重復(fù)在PCA圖中距離接近，且小于不同組織之間的距離，這說明兩種定量方式在生物重復(fù)間都具有高重現(xiàn)性（圖6C，D）。
圖6C：DIA定量的PCA結(jié)果；D：TMT定量的PCA結(jié)果
無監(jiān)督層次聚類分析：DIA-FAIMS與TMT所得的蛋白表達(dá)譜十分類似，這說明這兩種定量方法可提供類似的生物學(xué)信息（圖6E）。
圖6E：兩種方法定量結(jié)果的無監(jiān)督層次聚類結(jié)果
快速、靈敏、深度的磷酸化蛋白質(zhì)組
樣品：200μg Hela肽段經(jīng)磷酸化富集，12個(gè)組織樣品酶解肽段經(jīng)磷酸化富集
梯度：21分鐘（60個(gè)樣品每天）
Hela樣品：21分鐘可鑒定超過8000條unique磷酸化肽段，其中超過5000條可靠定位至單個(gè)氨基酸上（圖7A）。
圖7A：200 μg Hela肽段經(jīng)磷酸化富集后鑒定及定位的磷酸化肽段
組織樣品：采用directDIA的方式，在12個(gè)組織樣品中共鑒定到超過22000條unique磷酸化肽段，定位超過13000條磷酸化肽段（圖7B）。
圖7B：12個(gè)組織樣品酶解肽段經(jīng)磷酸化富集后鑒定及定位的磷酸化肽段
總結(jié)
- Exploris 480聯(lián)合FAIMS Pro適用于蛋白組學(xué)的各個(gè)方面，除了文中提到的DDA與DIA鑒定，極低量樣品分析，組織樣品，磷酸化樣品，以及TMT與DIA定量等，還可實(shí)現(xiàn)BOXCAR-DDA，BOXCAR-DIA，SureQuant等定量工作
- FAIMS可有效去除單價(jià)態(tài)的背景信號，可提高蛋白組覆蓋，擴(kuò)大動(dòng)態(tài)范圍，提高定量精度和準(zhǔn)確性
- TMTpro（TMT16標(biāo)）將進(jìn)一步提高TMT定量通量
全文鏈接
A Compact Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer with FAIMS InterfaceImproves Proteome Coverage in Short LC Gradients
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