藥物研發(fā)的好幫手-蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)

近年來，隨著生物藥市場和基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組治療性抗體或者單抗的需求在生物藥中的比例也逐年上升。重組mAbs被應(yīng)用于包括癌癥及免疫系統(tǒng)缺陷在內(nèi)的許多疾病的治療當(dāng)中。

重組mAbs通過基因工程技術(shù)改造后可以在多種宿主細胞表達。重組mAbs在表達后進行翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊、組裝及適當(dāng)?shù)奶腔�化才能具有生物學(xué)活性。由于各種生物的特性不同，適合表達蛋白的種類也不相同，不同宿主產(chǎn)生的mAbs，其生物活性和免疫原性也都各不相同。

 

大腸桿菌(E.coli)表達系統(tǒng)

 

在各種表達系統(tǒng)中，最早被采用進行研究的是大腸桿菌(E.coli)表達系統(tǒng)，其顯著的優(yōu)點是易于操作，產(chǎn)量高，成本低，但是由于用E.coli生產(chǎn)的蛋白在蛋白質(zhì)翻譯后缺乏加工機制，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊，在人體內(nèi)易被降解，得到具有生物活性的蛋白的幾率較小。此外，E.coli還易產(chǎn)生內(nèi)毒素超標(biāo)和包涵體等問題。

哺乳動物細胞表達系統(tǒng)

 

目前所有哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中，中國倉鼠卵巢（CHO）細胞應(yīng)用最為廣泛，由于其酷似人類的翻譯后修飾和內(nèi)在的蛋白質(zhì)折疊機制的優(yōu)點，是重組mAbs生產(chǎn)的首選平臺，占據(jù)了70%的重組mAbs生產(chǎn)制備，并且大部分為單克隆抗體。為了在早期治療性研究中得到毫克到克級的蛋白質(zhì)，蛋白瞬時表達系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用，目標(biāo)蛋白均可以在5-8周內(nèi)提供。這種快速的蛋白制備技術(shù)與穩(wěn)定細胞株構(gòu)架相比，大大縮短了研發(fā)周期，從而促進了生物治療藥物的研發(fā)進程。

根據(jù)目的蛋白表達的時空差異，可將哺乳動物細胞表達系統(tǒng)分為瞬時和穩(wěn)定表達系統(tǒng)。

1、瞬時表達系統(tǒng)是指以外源基因?qū)�入宿主細�?轉(zhuǎn)染)為基礎(chǔ)，在有限的時間內(nèi)表達的技術(shù)。轉(zhuǎn)染后，質(zhì)粒DNA分子留在細胞內(nèi)，不整合到基因組中，最終隨著時間的推移和細胞分裂而丟失。在抗體上清收獲之前，抗體上清的制備生產(chǎn)通常限于轉(zhuǎn)染后7-14天，時間比較短暫。瞬時表達系統(tǒng)的優(yōu)勢是操作過程簡捷，實驗周期短。另一個顯著的優(yōu)勢是瞬時表達的靈活性。只有改變質(zhì)粒DNA中包含的目的基因，就可以表達幾種蛋白質(zhì)，靈活性比較高。這些優(yōu)勢讓瞬時表達系統(tǒng)在抗體藥物早期的高通量篩選流程中承擔(dān)了很重要的角色。當(dāng)目的蛋白或者抗體由于毒性問題而不能讓細胞持續(xù)表達時，瞬時表達也是一種合適的選擇^[1,2]。此外，瞬時表達可以從非常小的規(guī)模（96孔板）^[3]擴大到大容量培養(yǎng)容器中（生物反應(yīng)器中的數(shù)百升）^[4]。

 

圖1.瞬時轉(zhuǎn)染元件^[5]

2、穩(wěn)定表達系統(tǒng)是指載體進入宿主細胞，經(jīng)過選擇加壓篩選培養(yǎng)，載體DNA穩(wěn)定整合在細胞內(nèi)，目的蛋白的表達持久、穩(wěn)定。由于需要抗性篩選、加壓擴增等步驟，穩(wěn)定表達相對實驗周期長，耗時耗力。

 

圖2.穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構(gòu)建流程^[6]

 

生物醫(yī)藥界“糖寶”-CHO

1957年美國科羅拉多大學(xué)的Puck教授從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得一種上皮貼壁型細胞，并建立了首批CHO細胞系，為命名為CHO-K1細胞系，是目前在生物領(lǐng)域中廣泛使用的細胞系^[7]。，此后建立了許多不同的細胞系，如CHO-S、CHOK1SV、DG44等^[8]。

 

圖3.CHO細胞發(fā)展^[9]

1、CHO細胞的應(yīng)用優(yōu)勢

那么為什么CHO細胞這么受大家的喜愛呢？不僅是因為為它具有穩(wěn)定傳代不死的性質(zhì)，它還具有下面幾大優(yōu)勢，讓新藥研發(fā)行業(yè)的同仁們對它愛不釋手。

1. 具有清晰地歷史背景和監(jiān)管機構(gòu)的認可，安全性高；

2. 具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達的蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能等方面最接近于天然蛋白分子；

3. 既可以貼壁生長，又可以懸浮培養(yǎng)，并且具有較高的耐受剪切力和滲透壓的能力；

4. 具有重組基因的高效擴增和表達能力，外源蛋白整合穩(wěn)定；

5. 具有產(chǎn)物胞外分泌的功能，并且很少幾乎不分泌自身的內(nèi)源蛋白，便于下游產(chǎn)物的分離與純化；

6. 能以懸浮培養(yǎng)方式或者在無血清培養(yǎng)基中達到高密度培養(yǎng)，可以大規(guī)模生產(chǎn)。

 

2、改善CHO細胞的表達水平

近年來，研究人員和細胞開發(fā)公司已經(jīng)開發(fā)了許多策略來改善CHO細胞表達水平。表達EBNA1蛋白或T抗原的CHO細胞系，其制備抗體的能力會得到增強。還有其它CHO細胞系基因工程策略，例如過表達未折疊蛋白應(yīng)答因子或敲除促凋亡基因，也可以顯著地增加CHO細胞的表達能力。表達工藝的優(yōu)化，如化學(xué)添加，溫度偏移，或更長的培養(yǎng)時間等方法，均可以增加其表達水平。

針對于轉(zhuǎn)染效率、生產(chǎn)力和生長特性，很多產(chǎn)品公司對CHO細胞進行改造及優(yōu)化，目前被應(yīng)用CHO-S細胞系，商品名為ExpiCHO-S^TM。ExpiCHO-S細胞經(jīng)懸浮培養(yǎng)后，呈最小的聚集趨勢，在表達培養(yǎng)基中呈高密度生長，能顯著提升瞬時表達的產(chǎn)量和效率。穩(wěn)定的細胞系表達能力，穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量和較高的產(chǎn)率，CHO細胞表達系統(tǒng)已成為生物制藥工業(yè)中制備大量蛋白質(zhì)的首選方法。相信在不久的將來，有更多高質(zhì)量的重組mAb通過CHO細胞制備出來。

好啦好啦，今天的基礎(chǔ)小知識分享到此結(jié)束，祝大家周末愉快，咱們后會有期啦~~

 

參考資料：

[1] Nallet S, Amacker M, Westerfeld N, et al. Respiratory syncytial virus subunit vaccine based on a recombinant fusion protein expressed transiently in mammalian cells. Vaccine. 2009;27:6415–6419.

[2] Mignaqui AC, Ruiz V, Perret S, et al. Transient gene expression in serum-free suspension-growing mammalian cells for the production of foot-and-mouth disease virus empty capsids. PLoS One. 2013;8:1–9.

[3] Raymond C, Tom R, Perret S, et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for largescale and high-throughput applications. Methods. 2011;55:44–51.

[4] Tuvesson O, Uhe C, Rozkov A, et al. Development of a generic transient transfection process at 100 L scale. Cytotechnology. 2008;56:123–136.

[5] Gutiérrez-Granados S, Cervera L, Kamen AA, et al. Advancements in mammalian cell transient gene expression (TGE) technology for accelerated production of biologics. Crit Rev Biotechnol. 2018 Sep;38(6):918-940.

[6] Lai T1, Yang Y, Ng SK. Advances in Mammalian Cell Line Development Technologies for Recombinant Protein Production. Pharmaceuticals (Basel). 2013 Apr 26;6(5):579-603. 

[7] PUCK TT. The genetics of somatic mammalian cells. Adv Biol Med Phys. 1957;5:75-101.

[8] Stolfa G1, Smonskey MT, Boniface R. CHO-Omics Review: The Impact of Current and Emerging Technologies on Chinese Hamster Ovary Based Bioproduction. Biotechnol J. 2018 Mar;13(3):e1700227. 

[9] Lewis NE, Liu X, Li Y, et al. Genomic landscapes of Chinese hamster ovary cell lines as revealed by the Cricetulus griseus draft genome. Nat Biotechnol. 2013 Aug;31(8):759-65. 
 

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