Leica SP8 DIVE多光子顯微鏡應(yīng)用紀(jì)要-腎臟類器官成熟研究

腎臟要正常發(fā)揮功能，需要多個(gè)高度特異性的不同細(xì)胞類型之間相互作用來完成。腎小球是腎的組成單元，由足細(xì)胞和腎小球血管組成。隨著一系列足細(xì)胞表達(dá)的基因突變導(dǎo)致的慢性疾病的深入研究，加強(qiáng)對(duì)足細(xì)胞發(fā)育和功能的理解、建立相關(guān)的體外足細(xì)胞模型是臨床前的當(dāng)務(wù)之急。

近日發(fā)表于“Developmental Cell”上的一項(xiàng)研究 In Vivo Developmental Trajectories of Human Podocyte Inform In Vitro Differentiation of Pluripotent Stem Cell-Derived Podocytes，分析了人類胚胎腎臟的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)，并與腎臟類器官來源的足細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行對(duì)比，揭示兩者的相似性，建立了從腎前體細(xì)胞到足細(xì)胞的發(fā)育軌跡和調(diào)節(jié)機(jī)制。

類器官（organoid）是一類干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)形成的能夠進(jìn)行自我組裝的微觀三維結(jié)構(gòu)。與對(duì)應(yīng)的器官擁有類似的空間組織并能夠重現(xiàn)部分生理功能，被認(rèn)為是檢測(cè)人類生物學(xué)和疾病方面的新模型。但是體外培養(yǎng)的類器官通常沒有血管系統(tǒng)，功能成熟受到限制。

為了確定類器官與血管細(xì)胞共同培養(yǎng)能使足細(xì)胞成熟，作者將體外培養(yǎng)的腎臟類器官（來源于 MAFB-P2A-eGFP H9 人胚胎干細(xì)胞）植入到 NOD SCID 小鼠腎包膜下，10 天之后，暴露移植的類器官，注射 Alexa594 偶聯(lián)的牛血清白蛋白標(biāo)記血漿（紅）。使用 Leica SP8 DIVE 多光子顯微鏡觀察在體血管生成和足細(xì)胞的發(fā)育。血流實(shí)時(shí)顯像顯示，移植 10 天后，宿主小鼠的循環(huán)系統(tǒng)對(duì)類器官有良好的血管形成作用（圖 1，視頻 1）。

▲ 圖 1.多光子圖像顯示移植 10 天后體外來源的足細(xì)胞周圍有明顯的血管包繞。Scale bars: 50 μm
 

得益于 Leica 新式的光譜式多光子顯微鏡 SP8 DIVE，研究者可以非常輕松實(shí)現(xiàn)偏紅染料 Alexa594 和 eGFP 的同時(shí)成像。

隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，在體水平觀察生物活體內(nèi)多組分之間的相互關(guān)系，已經(jīng)成為生物學(xué)家們的更高追求。SP8 DIVE 中的創(chuàng)新技術(shù)——4 Tune NDD 光譜檢測(cè)器可以靈活調(diào)節(jié)檢測(cè)范圍，輕松實(shí)現(xiàn) 4 種熒光的同步成像，也可避免相近染料的串色干擾，如 GFP 與 YFP 等（圖 2）。相較傳統(tǒng)的外置濾片式檢測(cè)，在檢測(cè)范圍、成像速度、同時(shí)檢測(cè)的熒光種類上有了質(zhì)的飛躍，實(shí)現(xiàn)了多光子同步跟蹤活體內(nèi)多組分變化的科學(xué)難題（圖 3）。

▲圖 2. 徠卡 SP8 DIVE 4 Tune NDD 檢測(cè)器

▲圖 3. 4 Tune NDD 實(shí)現(xiàn)了新的染料組合

左：小鼠大腦，綠色（小神經(jīng)膠質(zhì)，GFP）、黃色（神經(jīng)元，YFP）和藍(lán)色（星形膠質(zhì)細(xì)胞，磺酰羅丹明），血液系統(tǒng)（紅色，Alexa680 葡聚糖）

右：Confetti 小鼠小腸，結(jié)腸癌研究，青色：CFP ；綠色：GFP ；黃色：YFP ；紅色：RFP

SP8 DIVE 激發(fā)和發(fā)射兩端光譜自由可調(diào)在多色活體快速成像方面具備先天的優(yōu)勢(shì)；可輕松實(shí)現(xiàn)對(duì)活體動(dòng)物體內(nèi)深處的快速生理過程，如鈣離子、血管和組織內(nèi)物質(zhì)代謝、神經(jīng)環(huán)路等，進(jìn)行高速成像。

SP8 DIVE 是高分辨率快速深度活體成像的理想選擇！