如何使用KeyPro污染凈化儀防止RNA的降解和保證PCR的結(jié)果準確性

瀏覽次數(shù)：2152　發(fā)布日期：2020-2-19　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

在此次的新型冠狀病毒疫情中，核酸檢測作為確診的金標準發(fā)揮著重要的作用。眾所周知，本次新冠病毒的核酸檢測流程為采樣（咽拭子、肺泡灌洗液），提取病毒RNA，再經(jīng)過RT-qPCR或者一步法RT-數(shù)字PCR檢測樣本。但近期關(guān)于核酸檢測準確性的討論也甚囂塵上，其中PCR實驗污染是導(dǎo)致實驗有偏差的原因之一，造成PCR實驗污染的主要原因有以下幾點，樣本間交叉污染（樣本泄漏引起的交叉，樣本提取過程中移液器、耗材的污染），PCR試劑的污染（容器、耗材、移液器，水等被污染），PCR擴增產(chǎn)物污染，氣溶膠污染，克隆質(zhì)粒污染等。

在病毒核酸檢測過程中，結(jié)果的準確性除了檢測方式的靈敏度很重要以外，保證提取RNA樣本的完整性也十分重要。今天我們就聊聊如何防止RNA降解，獲得高質(zhì)量的RNA進行后續(xù)試驗。導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)就是RNase，RNase非常穩(wěn)定，且無處不在，用常規(guī)的高溫高壓蒸汽方法和蛋白酶抑制劑不能使所有的RNase完全失活。

RNase結(jié)構(gòu)

除上述方法外，研究人員最常用的就是使用DEPC等對實驗過程中使用的耗材和試劑進行處理，但DEPC處理時間長且有毒，下面給出遠離DEPC的三大理由：

1、DEPC 對人體有害，DEPC為高活性烷化試劑，能對蛋白質(zhì)進行共價稀釋，使其組氨基團的乙氧基甲酸化（RNase 活性位點有兩個組氨基酸，故能被滅活）；同時能使 RNA 分子中沒配對的腺嘌呤羥甲基化，改變其活性，嚴重時會影響 RNA 形成雜交雙鏈的能力，歸為強致癌物，使用時要十分小心。

2、不能處理一些試劑：例如：一級胺的試劑TRIS，PBS等，會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；二是不能高壓滅菌的試劑，DTT，dNTP，Mgcl2，因為 DEPC必須通過高壓滅菌去除；三是不能用于PH低于4及以下的試劑，DEPC在此條件下對RNase沒有滅活作用。

3、DEPC不適合某些實驗，測OD值的實驗，OD讀數(shù)跟 PH 有關(guān)， DEPC 在溶液中分解后變成乙醇和二氧化碳，部分二氧化碳與水反應(yīng)形成碳酸，導(dǎo)致 PH 降低，進而降低OD值。

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