MaxCyte流式電轉(zhuǎn)染平臺在新一代疫苗快速研發(fā)生產(chǎn)中的優(yōu)勢分析

 

日前，新型冠狀病毒（COVID-19）疫情仍在持續(xù)發(fā)展，截至目前，累計確診病例數(shù)已超過70000。盡管統(tǒng)計數(shù)據(jù)在不斷增加，但全國乃至全球抗擊疫情的決心和信心越來越強。對于疫情防控，其中最重要的研究工作是要盡早研發(fā)出針對2019-nCoV感染的預(yù)防性疫苗。研究表明，如果人群中有70%以上的人接種了相應(yīng)疫苗，就有可能有效阻斷病毒在人群中的廣泛傳播。對普通民眾來說，疫苗仍然是防控傳染病最有效的手段。大家越來越關(guān)心疫苗研制目前在什么階段、什么時候能夠上市。

那么，什么是疫苗？疫苗研發(fā)需要多久？疫苗是將病原微生物（如細菌、病毒、立克次體）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒滅活或利用基因工程等方法制成的，用于預(yù)防傳染病的自動免疫制劑。18世紀(jì)末英國人簡納（E.Jenner）在人痘接種基礎(chǔ)上發(fā)明了牛痘接種術(shù)，標(biāo)志著歷史上第一劑疫苗發(fā)明，是古典疫苗時期的開始。隨著微生物學(xué)的發(fā)展及當(dāng)時霍亂、炭疽桿菌以及狂犬病，19世紀(jì)末法國科學(xué)家巴斯德通過系統(tǒng)的科學(xué)實驗，將病原微生物進行培養(yǎng)、減毒或滅活，使其毒力降低或消失，制出了雞霍亂桿菌菌苗、炭疽菌苗、狂犬病毒疫苗等。最近幾十年遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程等學(xué)科得到飛速發(fā)展，研制疫苗的技術(shù)水平也不斷提升。科學(xué)家通過提取或人工合成病原微生物的有效抗原成分而制成亞單位疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗等，這類疫苗安全，副作用較少，無毒力返祖的危險。

 

 

對于甲流等大規(guī)模流行性傳染疾病，疫苗的生產(chǎn)主要還是利用傳統(tǒng)方法，以雞胚為載體來培養(yǎng)種子毒株，獲得滅活或減毒疫苗，但研發(fā)及生產(chǎn)周期較長，當(dāng)年SARS滅活疫苗研制出來的時候病毒都已經(jīng)銷聲匿跡，甚至都沒有在臨床上進行使用。據(jù)報道，國內(nèi)外超過30家團隊已經(jīng)開展針對新冠病毒的疫苗研發(fā)，其中核酸和重組蛋白等疫苗研發(fā)團隊不僅占據(jù)了大多數(shù)，而且進展也相當(dāng)快，美國Moderna公司和上海斯微的mRNA疫苗、中科院微生物所的重組蛋白疫苗等已經(jīng)在進行動物實驗。

 

當(dāng)前部分新冠病毒疫苗研發(fā)機構(gòu)和企業(yè)

機構(gòu)/企業(yè)	疫苗類型
中國疾控中心	傳統(tǒng)滅活疫苗
浙江大學(xué)傳染病診治重點實驗室	傳統(tǒng)滅活疫苗
斯微生物/同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院	mRNA疫苗
中科院先進技術(shù)研究院	mRNA疫苗
美國Moderna公司	mRNA疫苗
美國CureVac公司	mRNA疫苗
美國Inovio公司	DNA疫苗
中科院微生物研究所	重組蛋白疫苗
香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院	重組蛋白疫苗
澳大利亞昆士蘭大學(xué)	重組蛋白疫苗
成都三葉草生物制藥	重組蛋白疫苗
武漢博沃公司/美國GeoVax Labs	病毒載體疫苗
美國強生公司	腺病毒載體疫苗

 

疫苗是目前人類唯一可以有預(yù)測地消滅某一疾病的有效武器，但是疫苗本身也存在局限性，病毒一旦發(fā)生變異，原有的疫苗也即失去功效。且疫苗研制周期漫長，得益于核酸、重組蛋白等新型疫苗研究技術(shù)，目前針對COVID-19的疫苗最早4月份進入臨床實驗，比SARS疫苗研制進展提高了很多，但是距離上市還有相當(dāng)一段時間，面對此次傳播力如此強的病毒，疫苗早一天上市就可能多挽救一批奮戰(zhàn)在一線的醫(yī)務(wù)人員及無辜感染者。
 

MaxCyte公司是全球電轉(zhuǎn)領(lǐng)域的先行者和技術(shù)領(lǐng)導(dǎo)者，專注細胞電轉(zhuǎn)技術(shù)超過20年，提供全球領(lǐng)先的細胞轉(zhuǎn)染解決方案，其專利性的通用型流式電轉(zhuǎn)染技術(shù)是經(jīng)臨床驗證的快速、高質(zhì)量細胞轉(zhuǎn)染平臺，能夠?qū)�DNA、RNA、siRNA、蛋白質(zhì)或細胞裂解物轉(zhuǎn)染到各種細胞系和原代細胞中，系統(tǒng)內(nèi)置多種經(jīng)過驗證的電轉(zhuǎn)實驗方案，轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率可達90%以上，能夠在30分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)染多達2×10¹⁰個細胞，放大生產(chǎn)無需再次優(yōu)化轉(zhuǎn)染流程，適用于前期研發(fā)、臨床實驗到商業(yè)化生產(chǎn)全過程，且符合cGMP生產(chǎn)規(guī)范，操作簡單，系統(tǒng)“即插即用”。 MaxCyte轉(zhuǎn)染平臺可用于重組蛋白和疫苗研發(fā)及生產(chǎn)，高性能瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)能夠快速開發(fā)和制造完整、大量的新一代疫苗，包括治療性抗體和抗體樣分子、亞單位疫苗、病毒樣顆粒（VLPs）、病毒樣復(fù)制子顆粒（VRPs）和病毒載體，無需其它穩(wěn)定表達細胞、桿狀病毒、脂質(zhì)體或化學(xué)轉(zhuǎn)染方式，能夠大大縮減抗體和疫苗從研制到上市的時間。

 

MaxCyte通用流式細胞電轉(zhuǎn)染平臺

 

圖1. 高性能瞬時轉(zhuǎn)染                                           圖2.  快速大量蛋白生產(chǎn)
 

MaxCyte系統(tǒng)利用流式電轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染原代細胞、哺乳動物細胞、干細胞和昆蟲細胞，具有高轉(zhuǎn)染效率和細胞活率，實現(xiàn)細胞、細胞表面或分泌蛋白的高水平表達。MaxCyte瞬時轉(zhuǎn)染平臺可快速生產(chǎn)大量用于治療或疫苗的蛋白質(zhì)，包括單特異性和多特異性抗體、VLP、VRP、包膜蛋白、其他重組蛋白，以及來自CHO、HEK、Vero、昆蟲細胞和各種其他細胞系的病毒載體。MaxCyte瞬時轉(zhuǎn)染CHO細胞在兩周內(nèi)能夠獲得大于1g/L抗體產(chǎn)量，滿足臨床前實驗所需蛋白量，且放大生產(chǎn)無需重新優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法，無論是少量還是大量轉(zhuǎn)染產(chǎn)量都具有極高的穩(wěn)定性，可極大縮短抗體研發(fā)到生產(chǎn)的時間。此外，流動電轉(zhuǎn)染的高轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率使得在瞬時運行的同時選擇穩(wěn)定的細胞系，進一步簡化抗體的研發(fā)流程，可在轉(zhuǎn)染后8周內(nèi)產(chǎn)生高產(chǎn)穩(wěn)定的克隆。

MaxCyte助力新一代疫苗快速研發(fā)生產(chǎn)
利用MaxCyte流式電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)直接轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，不使用桿狀病毒做載體，從質(zhì)粒到蛋白表達的時間縮短到數(shù)天（圖3）。對于大規(guī)模傳染病病、生物防御及季節(jié)性流感的快速反應(yīng)疫苗生產(chǎn)會有很大幫助。MaxCyte轉(zhuǎn)染過程的簡單性能夠顧及到區(qū)域性的“盒裝疫苗”生產(chǎn)設(shè)施，同樣的平臺也可用于其他相關(guān)細胞類型的生物制造，如CHO、HEK、Vero和MDCK細胞。

MaxCyte用于病毒載體、VLP和疫苗生產(chǎn)的優(yōu)勢：

• 無縫放大生產(chǎn)， 30分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)染多達2×10¹⁰個細胞
• 適用多種病毒生產(chǎn)細胞系
• 無需桿狀病毒系統(tǒng)在數(shù)天內(nèi)獲得目的蛋白
• 能夠共轉(zhuǎn)染多個質(zhì)粒或大質(zhì)粒
• 軟件控制，封閉轉(zhuǎn)染環(huán)境
• FDA批準(zhǔn)的細胞轉(zhuǎn)染技術(shù) 

病毒樣顆粒（VLP）比滅活或減毒活病毒疫苗具有更高的安全性，是很有前景的疫苗生產(chǎn)技術(shù)。VLPs由一個或多個重組表達的病毒結(jié)構(gòu)蛋白組成，這些蛋白自組裝成復(fù)合物，緊密模仿原生病毒的三維結(jié)構(gòu)，可用于多種病毒，包括流感病毒。VLPs是用包括哺乳動物和昆蟲細胞在內(nèi)的多種細胞制造的。因為它們在翻譯后以類似哺乳動物細胞的方式修飾蛋白質(zhì)。雖然瞬時轉(zhuǎn)染和重組桿狀病毒平臺都是昆蟲細胞蛋白表達的常用方法，但MaxCyte電轉(zhuǎn)染技術(shù)為VLP的產(chǎn)生提供了一種更快速和直接的方法。

通過MaxCyte電轉(zhuǎn)染將編碼三種VLP抗原的表達載體轉(zhuǎn)染到SF9細胞，同時，桿狀病毒表達系統(tǒng)被用于產(chǎn)生含有相同三種抗原的VLPs。在48小時內(nèi)經(jīng)電轉(zhuǎn)染的細胞即開始顯著分泌VLP，細胞上清液的SDS-PAGE分析顯示，在電轉(zhuǎn)染和桿狀病毒樣本中均存在三種VLP抗原，但桿狀病毒感染細胞的上清液中也存在桿狀病毒蛋白污染物，利用MaxCyte電轉(zhuǎn)染技術(shù)直接轉(zhuǎn)染昆蟲細胞具有極其快速和高質(zhì)量的特性，通過消除桿狀病毒的使用，簡化了VLP的生產(chǎn)流程。

 

圖3. MaxCyte生產(chǎn)SF9 VLP：2-4天內(nèi)實現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)。用一個編碼三種抗原的質(zhì)粒通過小規(guī)模電轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染SF9細胞，共組裝成VLPs。從電轉(zhuǎn)后或桿狀病毒感染后不同時間中收集細胞培養(yǎng)液，并用SDS-PAGE進行分析。
 

Alphaviruses具有廣泛的細胞傾向性，但優(yōu)先感染樹突狀細胞，來充當(dāng)抗原呈遞細胞（APCs）的傳遞載體，進而刺激體液和細胞免疫反應(yīng)。甲病毒衍生顆粒VRPs（病毒樣復(fù)制子顆粒），代表了下一代疫苗研發(fā)技術(shù)，特別是針對NIH風(fēng)險3組病毒（如H5N1、HIV、埃博拉等），因為低生物接觸設(shè)施可用于生產(chǎn)非致病性VRPs。VRP對致病因子和癌癥免疫治療的作用已經(jīng)被評估，并證明在多種動物和人類中是安全的，并能誘導(dǎo)保護性免疫。

VRP的制備是通過表達抗原（以mRNA或DNA質(zhì)粒的形式）的甲病毒載體和表達甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的輔助RNA或DNA質(zhì)粒瞬時（共）轉(zhuǎn)染細胞，然后收獲含有VRP的培養(yǎng)基，Vero和BHK是最常用的細胞系，但其他的包括CHO和HEK也被使用。通過Vero細胞電轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的VRPs已進入臨床研究。

電轉(zhuǎn)染技術(shù)是一種高效轉(zhuǎn)染Vero細胞的方法。利用MaxCyte進行甲病毒VRP實驗，比較了當(dāng)前的最優(yōu)方法。評估兩種VRP的制備，一種表達綠色熒光蛋白，另一種表達HIV-Gag蛋白。對于這兩種轉(zhuǎn)染方法，基于RNA的輔助結(jié)構(gòu)支持更高水平的VRP產(chǎn)生，特別是對于基于MaxCyte電轉(zhuǎn)染的方法，其VRP產(chǎn)生率是使用RNA的5倍。當(dāng)使用RNA復(fù)制子和RNA輔助子時，電轉(zhuǎn)染導(dǎo)致GFP和HIV-Gag表達VRPs的產(chǎn)量比當(dāng)前最佳方法高9倍。

 

圖4. MaxCyte電轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染技術(shù)產(chǎn)生顯著增加的VRP產(chǎn)量
 

此次新冠病毒給中國造成了巨大創(chuàng)傷，相信疫情終將過去，我們的生活也終將歸于平靜，但是人類和病毒的較量永遠不會停止，人類研發(fā)疫苗的腳步也不會停止。無論是高致病性的H1N1、COVID-19、SARS，或是高致死率的MERS、Ebola，還是人類斗爭了幾十年的HIV等，每一次面對病毒的進攻人類好像始終都沒有做好充足準(zhǔn)備，而且你永遠無法預(yù)知下一次病毒爆發(fā)是什么時候，除了保持警惕防患未然，或許我們還需要做的是讓我們武器庫里的武器始終保持鋒利。我們期待疫情即早得到控制，我們期待疫苗研發(fā)及早成功利國利民！