南模生物小鼠模型在揭示減數(shù)分裂同源重組命運決定的表觀遺傳學的應(yīng)用

減數(shù)分裂為生殖細胞所特有的生物學事件，是生物有性生殖的基礎(chǔ)。在減數(shù)分裂過程中，同源染色體的非姐妹染色單體間發(fā)生配對、聯(lián)會和重組交換，而非同源染色體分配時自由組合，從而使配子呈現(xiàn)遺傳多樣化，增加了后代的適應(yīng)性【1】。因此，減數(shù)分裂是保證物種繁衍、染色體數(shù)目穩(wěn)定和物種適應(yīng)環(huán)境變化而不斷進化的基本前提。遺傳變異是否與表觀遺傳調(diào)控有關(guān)是學術(shù)界長期關(guān)注的問題，本研究為回答該問題提供了一些重要線索。

同源重組是減數(shù)分裂的核心事件，它不僅是減數(shù)分裂過程中遺傳物質(zhì)交換的基礎(chǔ)，也是同源染色體正確分離的保障。其過程高度復(fù)雜且受到嚴密調(diào)控。以小鼠為例，減數(shù)分裂同源重組起始于SPO11和GM960復(fù)合物所介導的DNA雙鏈斷裂 (Double-Stranded Breaks, DSBs)；隨后，斷裂位點經(jīng)5’末端切割、單鏈入侵等而使DSB獲得修復(fù)；最終在同源染色體之間形成交叉（Crossover）或非交叉（Non-Crossover）【2】，其中，大部分DSBs修復(fù)形成非交叉，大約僅有10% DSBs修復(fù)生成交叉。

DSB位點并非隨機分布，而是具有明顯的偏好性，稱之為熱點（hotspot）。盡管已知PRDM9及其介導的H3K4me3修飾在在多數(shù)哺乳動物DSB熱點選擇中發(fā)揮著關(guān)鍵作用【3-5】，但是，關(guān)于PRDM9介導的H3K4me3在DSB修復(fù)過程中是如何演化的，PRDM9及其介導的H3K4me3是否參與調(diào)控DSB修復(fù)過程即同源重組命運決定，以及其它表觀修飾因子是否也在其中發(fā)揮作用，等等，目前均不清楚。因為難以獲取高純度的各種亞型的哺乳動物減數(shù)分裂前期I細胞，所以同源重組命運決定機制一直是哺乳動物減數(shù)分裂研究的難點和熱點。

2020年2月11日，中科院分子細胞卓越創(chuàng)新中心（上海生物化學與細胞生物學研究所）童明漢課題組與復(fù)旦大學生物醫(yī)學研究院/附屬中山醫(yī)院藍斐課題組、北京大學湯富酬課題組合作在Cell Research上發(fā)表論文“Refined spatial temporal epigenomic profiling reveals intrinsic connection between PRDM9-mediated H3K4me3 and the fate of double-stranded breaks”。

與之前PRDM9決定DSB熱點研究不同，該文提出PRDM9及其介導的H3K4me3協(xié)同局部染色質(zhì)環(huán)境可能參與了DSB修復(fù)過程，與同源重組命運決定相關(guān)；發(fā)現(xiàn)早期生成的DSBs更傾向于修復(fù)形成交叉。本文不僅為同源重組命運決定和交叉穩(wěn)態(tài)的調(diào)控研究提供了新視角，也證實了遺傳物質(zhì)交換機制和表觀遺傳調(diào)控的相關(guān)性。

南模生物為該研究提供了Prdm9-3×(HA-Flag)、Lin28-YFP、Stra8-GFPCre、Vasa-mCherry小鼠模型。
 

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得益于童明漢課題組前期建立的分離小鼠任意類型生精細胞的技術(shù)體系，使獲取高純度同步發(fā)育的任意類型生精細胞成為現(xiàn)實，因此有可能對精子發(fā)生過程中關(guān)鍵生物學事件的分子機制進行精細研究。比如，童明漢課題組曾經(jīng)基于上述體系與湯富酬、李勁松課題組合作，2018年7月30日在Cell Research上發(fā)表了題為“Single-cell RNA-seq uncovers dynamic processes and critical regulators in mouse spermatogenesis”的論文，繪制了精子發(fā)生過程中生精細胞轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)變化圖譜，系統(tǒng)地闡明了這種動態(tài)變化的可能分子基礎(chǔ)，為哺乳動物精子發(fā)生調(diào)控的分子機制研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)【6】。
 

圖1: 基于精細分期的減數(shù)分裂重組過程表觀遺傳組的建立

作為減數(shù)分裂系列研究的一部分，為了闡明表觀遺傳是否以及如何調(diào)控減數(shù)分裂同源重組，本文在純化各級生精細胞的基礎(chǔ)上，將減數(shù)分裂前期I細胞細分為7個時期進行研究（圖1），結(jié)合ChIP-seq技術(shù)，分析了包括H3K4me3在內(nèi)的8種組蛋白修飾在減數(shù)分裂前后的動態(tài)變化；應(yīng)用NOMe-seq，觀察了DNA甲基化以及染色質(zhì)開放狀態(tài)的動態(tài)變化（圖1），揭示了之前難以發(fā)現(xiàn)的減數(shù)分裂前期I細胞演化的未知規(guī)律。
 

結(jié)果顯示，PRDM9介導的H3K4me3修飾在細線期(Leptotene)開始生成，至偶線期中期達到峰值，隨后逐步消失（圖2a）；同時，越早產(chǎn)生的H3K4me3越晚消失。這種H3K4me3動態(tài)變化與DSB修復(fù)過程中同源重組中間產(chǎn)物的演變高度相關(guān)，提示PRDM9介導的H3K4me3可能參與了DSB修復(fù)過程。根據(jù)生成和消失時間，研究人員繼而將與重組熱點相關(guān)的H3K4me3分為四種類型，發(fā)現(xiàn)早期產(chǎn)生的H3K4me3信號強度與寬度均最強，且富集了更長的PRDM9結(jié)合基序（圖2b-e）；那些快速消失的H3K4me3信號強度與寬度均最弱，且為較晚產(chǎn)生。這些結(jié)果表明早期生成的PRDM9介導的H3K4me3可能通過影響同源重組穩(wěn)定中間體dHJ(double Holliday Junction)，從而進一步調(diào)控交叉形成；而那些弱而快速消失的則指導生成非交叉。
 

與H3K4me3相比，H3K4me1修飾在重組熱點上出現(xiàn)得更早，消失得更晚，并且覆蓋了更多的核小體（圖3）。有意思的是，在偶線期階段可以明顯觀察到DSB核心區(qū)域核小體H3K4me1被H3K4me3所替代的情況。鑒于體外實驗證實PRDM9具有催化H3K4me1的活性，研究人員推測H3K4me1可能是PRDM9催化產(chǎn)生H3K4me3過程的中間態(tài)；而早出現(xiàn)的H3K4me1則提示重組熱點決定發(fā)生的時間可能更早。
 

圖3：重組熱點相關(guān)H3K4me1修飾的特性

除上述修飾外，本研究還發(fā)現(xiàn)了H3K36me3與H3K27ac也富集于重組熱點，而H3K9me2修飾則缺失于重組熱點；同時，觀察到重組熱點區(qū)域的染色質(zhì)與全基因組相比更加開放。有意思的是，不論H3K36me3與H3K27ac的富集，還是H3K9me2的缺失，抑或染色質(zhì)的開放，均隨Prdm9敲除而變化，表明上述表觀因子均為PRDM9依賴性的。與H3K4me3類似，相比于其它類型，早期產(chǎn)生的H3K36me3與H3K27ac具有更強的信號強度與寬度，染色質(zhì)也最為開放，提示H3K36me3, H3K27ac以及染色質(zhì)開放可能與H3K4me3一起共同在DSB命運決定中發(fā)揮調(diào)控作用。同時，研究者根據(jù)所上述表觀遺傳規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了4537個潛在的DSB熱點，其中置信度最高的302個位點值得后續(xù)進行深入的機理分析。
 

綜上所述，本研究系統(tǒng)地闡述了PRDM9介導的H3K4me3以及H3K4me1、H3K36me3、H3K27ac、H3K9me2和染色質(zhì)開放在減數(shù)分裂過程及其前后的動態(tài)變化，闡明了PRDM9及其介導的H3K4me3修飾與DSB命運決定的相關(guān)性，提出了“PRDM9及其介導的H3K4me3修飾不但能決定DSB位點選擇，而且可能調(diào)控DSB形成后的修復(fù)過程，從而決定DSB命運”的假說（圖4）。該假說將是相關(guān)團隊的下一個重點研究目標。
 

圖4：DSB命運決定的表觀遺傳學基礎(chǔ)

據(jù)悉，中國科學院分子細胞卓越創(chuàng)新中心（上海生物化學與細胞生物學研究所）陳瑤博士，復(fù)旦大學呂瑞途博士、榮博文博士生，北京大學未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心博士生鄭宇軒與中國科學院分子細胞卓越創(chuàng)新中心（上海生物化學與細胞生物學研究所）林震博士為共同第一作者。該工作受到了中國科學院分子細胞卓越創(chuàng)新中心動物實驗技術(shù)平臺和細胞分析技術(shù)平臺的大力支持

參考文獻

1. Baudat, F., Imai, Y. & de Massy, B. Meiotic recombination in mammals: localization and regulation.Nat Rev Genet 14, 794-806, doi:10.1038/nrg3573 (2013).

2. Hunter, N. Meiotic Recombination: The Essence of Heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol 7, doi:10.1101/cshperspect.a016618 (2015).

3. Baudat, F. et al. PRDM9 is a major determinant of meiotic recombination hotspots in humans and mice. Science 327, 836-840, doi:10.1126/science.1183439 (2010).

4. Myers, S. et al. Drive against hotspot motifs in primates implicates the PRDM9 gene in meiotic recombination. Science 327, 876-879, doi:10.1126/science.1182363 (2010).

5. Parvanov, E. D., Petkov, P. M. & Paigen, K. Prdm9 controls activation of mammalian recombination hotspots. Science 327, 835, doi:10.1126/science.1181495 (2010).

6. Chen, Y. et al. Single-cell RNA-seq uncovers dynamic processes and critical regulators in mouse spermatogenesis. Cell Res 28, 879-896, doi:10.1038/s41422-018-0074-y (2018).