Maurice iCIEF法在疫苗質(zhì)量控制的應(yīng)用

 

Isoelectric point determination of live polioviruses by capIllary isoelectric focusing with whole column imaging detection,Anal Chem, 85 (12), 6089-94 2013 Jun 18.

3. 諾如病毒病毒樣顆粒等電點(diǎn)分析
 

加拿大圭爾夫大學(xué)食品安全研究所利用iCIEF，觀察6個(gè)不同種類的諾如病毒病毒樣顆粒（norovirus virus-like particles, VLPs）的pI峰型圖�？梢杂^察到每個(gè)VLP都有一個(gè)主峰（用于確定pI）和幾個(gè)小峰。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，不同顆粒大小的VLP可以呈現(xiàn)不同的pI值。由于顆粒的不穩(wěn)定，可以降解形成不同分子量的切割產(chǎn)物，因此構(gòu)成峰形圖中的小峰。
 

利用iCIEF觀察諾如病毒病毒樣顆粒的pI峰重現(xiàn)性。結(jié)果顯示，利用iCIEF檢測(cè)到諾如病毒病毒樣顆粒的pI峰重現(xiàn)性很好。

Isoelectric Point Determination of Norovirus Virus-Like Particles by CapIllary Isoelectric Focusing With Whole Column Imaging Detection, Anal Chem, 76 (1), 48-52 2004 Jan 1.

4. 脂質(zhì)納米顆粒疫苗表面電荷表征
 

脂質(zhì)納米顆粒（LNP）除了用于小分子，siRNA，mRNA和pDNA的藥物遞送，還被用于治療和疫苗的研發(fā)。

Merck疫苗分析和開發(fā)部門第一次基于成像毛細(xì)管等電聚焦（iCIEF）表征LNPS包裝的mRNA的疫苗。他們利用iCIEF，通過對(duì)兩性電解質(zhì)以及甘油的添加來優(yōu)化檢測(cè)LNP的表觀pI。確定好優(yōu)化條件后，對(duì)不同LNP樣品的三種獨(dú)立制劑之間的pI進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)，結(jié)果顯示三次樣品的峰形保持一致，重現(xiàn)性很好。通過測(cè)試了五種濃度的mRNA的LNP樣品的pI，使用線性回歸分析，將標(biāo)準(zhǔn)品（LNP）的峰面積對(duì)mRNA濃度（μg/mL）作圖。結(jié)果顯示，該線性范圍的測(cè)定系數(shù)（R²）為0.997，顯示出很強(qiáng)的線性
度，證明了該技術(shù)進(jìn)行定量分析的能力。
 

配制不同的LNP批次，每個(gè)批次包含不同的陽離子脂質(zhì)與mRNA的比率（摩爾/摩爾）。利用iCIEF對(duì)所有制備的LNP的進(jìn)行表觀pI檢測(cè)，然后將pI值與陽離子脂質(zhì)和mRNA濃度作對(duì)數(shù)圖。結(jié)果顯示，LNP表觀pI與陽離子脂質(zhì)濃度有很強(qiáng)的相關(guān)性，R2 = 0.956，但與mRNA濃度相關(guān)性很弱，R2 = 0.653。揭示了陽離子脂質(zhì)位于LNP表面，而mRNA位于LNP內(nèi)部。且LNP充當(dāng)保護(hù)mRNA的保護(hù)性疏水屏障。
 

利用iCIEF檢測(cè)有無裝載mRNA的LNP的表觀pI。結(jié)果顯示，帶有和不帶有mRNA的LNP在大約7.7處具有相似的pI。但包含mRNA的LNP的峰面積大于不包含mRNA的LNP的峰面積。這可能是散射光和mRNA吸光度組合的原因。
 

為了證明LNP的表觀pI取決于LNP表面的陽離子脂質(zhì)，用iCIEF檢測(cè)兩種不同pKa的陽離子脂質(zhì)的LNP的pI。結(jié)果顯示，LNP的pI分離是基于陽離子脂質(zhì)pKa值。用iCIEF方法可用于鑒定LNP樣品中的陽離子脂質(zhì)。
 

用iCIEF方法可以檢測(cè)熱應(yīng)激時(shí)LNP的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，隨著溫度的升高，未裝載mRNA（圖B）的LNP出現(xiàn)輕微的酸移和尖峰，意味著空的LNP隨著溫度的升高產(chǎn)生不穩(wěn)定或者發(fā)生聚集。裝載mRNA的LNP（圖A）隨著溫度的升高，“酸性變異體”與主峰基線分離得越大。這可能是由于溫度的升高，mRNA暴露在LNP表面而造成的。

Development of an imaged capIllary isoelectric focusing method for characterizing the surface charge of mRNA lipId nanoparticle vaccines, Electrophoresis, 40 (18-19), 2602-2609 Sep 2019.

5.重組乙肝疫苗制劑穩(wěn)定性研究
 

Merck疫苗研發(fā)中心，利用iCIEF考察重組乙肝疫苗，在3種不同制劑緩沖液及不同凍融次數(shù)情況下，等電點(diǎn)變異以及圖譜穩(wěn)定性。從而判斷疫苗制劑緩沖液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，利用iCIEF觀察到，從制劑緩沖液A到C這三種制劑中的pI值2.7均沒有變化。但在1x~5x凍融循環(huán)后，在制劑緩沖液B和C中觀察到了spikes峰，但在制劑緩沖液A的峰型仍然很穩(wěn)定。因此，與配方緩沖液B或C相比，配方緩沖液A為HBsAg提供了最穩(wěn)定的緩沖體系。

Development of Imaged CapIllary Isoelectric Focusing (iCIEF) method and Use of CapIllary Zone Electrophoresis (CZE) in Hepatitis B Vaccine (RECOMBIVAX HB®). Electrophoresis, 35 (7), 1072-8 Apr 2014.

6.結(jié)合疫苗載體蛋白的驗(yàn)證、工藝評(píng)價(jià)、穩(wěn)定性研究
 

對(duì)CRM197蛋白的驗(yàn)證除了可以通過將pI值和電泳圖譜與參考標(biāo)準(zhǔn)譜圖相匹配，此外，可以通過結(jié)合靶向CRM197的mAb來闡明該CRM197蛋白的特異性。

Merck疫苗分析開發(fā)研究實(shí)驗(yàn)室，利用iCIEF觀察，在用其特異性抗CRM197 mAb滴定CRM197時(shí)，電泳圖譜發(fā)生的變化。結(jié)果顯示，電泳圖譜以約1：1的摩爾比時(shí)停止變化。另外，此CRM197的酸性峰也與其主峰一起移動(dòng)，表明這些酸性形式在與其抗CRM197 mAb結(jié)合方面也具有活性。
 

利用iCIEF評(píng)價(jià)CRM197的上游和下游工藝。結(jié)果顯示，上游樣品S1和S2的濃度測(cè)量結(jié)果的RSD<15％，樣品S3和S4的RSD<5％。體現(xiàn)了iCIEF方法的高分辨率，以及可以用于快速篩選最高的細(xì)胞克隆生產(chǎn)者和最佳的發(fā)酵條件，以提供最大的CRM197效價(jià)。
 

利用iCIEF監(jiān)視貯存過程中蛋白的電荷異質(zhì)性，作為產(chǎn)品穩(wěn)定性評(píng)估的一部分。結(jié)果顯示，在3個(gè)月的存儲(chǔ)期間（22℃），CRM197的酸性峰（pI 5.77和5.82）增加，而主峰（pI 5.9）降低。

利用iCIEF觀察CRM197在四個(gè)不同溫度下三個(gè)月的穩(wěn)定性曲線。在22℃（紅線）下，酸性峰面積增加，主峰面積減少；在4℃（藍(lán)線）下，酸性峰面積增加慢得多，表明在此溫度下三個(gè)月內(nèi)略有降解。在-20℃（綠線，）和-70℃（黑線）的酸性峰沒有變化，表明此CRM197在這兩個(gè)溫度下非常穩(wěn)定。
Use of imaged capIllary isoelectric focusing technique in development of diphtheria toxin mutant CRM197, Electrophoresis,35 (7), 1065-71 Apr 2014.



Merck生物制劑和疫苗研究實(shí)驗(yàn)室，利用iCIEF的280nm紫外吸收和熒光模式，檢測(cè)不同發(fā)酵條件下，疫苗常用載體蛋白CRM197的pI差異。結(jié)果顯示，在吸收光模式下，S1和S4沒有從其它雜質(zhì)中分離出來。但是在熒光模式下，所有四個(gè)樣品中均清楚地觀察到CRM197，體現(xiàn)了iCIEF熒光模式下更高的靈敏度和選擇性。

Quantitation of CRM197 using imaged capIllary isoelectric focusing with fluorescence detection and capIllary Western, Anal Biochem, 534, 19-23 2017 Oct 1.