科學(xué)家利用亞微米紅外首次直觀揭示神經(jīng)元中淀粉樣蛋白聚集機理

      老年神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥(AD)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、Ⅱ型糖尿病等，目前困擾著全世界大約5億人，且這個數(shù)字仍在不斷迅速增長。尤其是阿爾茲海默癥（占70%以上），目前仍未有行之有效的診斷方法，因此無法得到有效的治療或預(yù)防。盡管當代病理學(xué)研究已經(jīng)證實這種病理變化與具有神經(jīng)毒性的β淀粉樣蛋白質(zhì)的聚集有關(guān)，但其在神經(jīng)元或腦組織中的聚集機制目前尚不清楚�，F(xiàn)有的方法, 如電子顯微鏡、免疫電子顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、超分辨顯微鏡，通常都需要對樣品進行化學(xué)加工（標記染色等）,可能會對淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)本身造成影響。而非標記方法，如表面增強拉曼光譜（SERS）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）, 前者受限于亞細胞水平上的低信噪比、自發(fā)熒光及不可逆的光損傷，后者其空間分辨率受限于紅外光波長（≈5–10 μm），且光譜可解譯性和準確性受到彈性細胞光散射所產(chǎn)生的米氏散射效應(yīng)(Mie scattering effects)的嚴重影響，使得直接在亞微米尺度上研究淀粉樣蛋白質(zhì)在神經(jīng)元內(nèi)的聚集行為十分困難。
 

      美國Photothermal Spectroscopy（PSC）公司開發(fā)的全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)mIRage， 是基于的光學(xué)光熱誘導(dǎo)共振（O-PTIR）技術(shù)，它克服了傳統(tǒng)FTIR技術(shù)的衍射極限和米氏散射效應(yīng)，紅外光譜空間分辨率高達500 nm，且無需對樣品進行標記, 不再需要衰減全反射（ATR）技術(shù)進行厚樣品測試，且能夠無接觸和無損探測樣品，全程對樣品無污染，可以幫助科研人員更全面地了解亞微米尺度下樣品表面微小區(qū)域的化學(xué)信息，使得在亞細胞水平揭示生物分子結(jié)構(gòu)成為了可能。美國Photothermal Spectroscopy（PSC）公司開發(fā)的全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)mIRage（如圖1A所示），使用可見探測束（532 nm）來測量樣品在脈沖紅外光束照射下的紅外光熱響應(yīng)，具體體現(xiàn)為樣品反射率的變化，由于使用了可見光作為檢測光，使得其空間分辨率不再依賴于入射紅外光的波長，且單一特定探測光束的使用還可以消除米氏散射效應(yīng)。           
                    

圖1. (A) 美國PSC公司非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)mIRage實物圖；（B）亞微米紅外成像示意圖：神經(jīng)元樹突的AFM形貌圖,其中神經(jīng)元直接在CaF₂基底下生長。mIRage采用兩束共線性光束: 532 nm可見(綠色)提取光束和脈沖紅外(紅色)探測光束，樣品的光熱響應(yīng)被檢測為樣品由于對脈沖紅外光束的吸收而引發(fā)的綠色光部分強度的損失，使紅外檢測的空間分辨率提高到≈500 nm. (C) 小鼠大腦皮層初級神經(jīng)元, 在CamKII促進下表達為tdTomato熒光蛋白，使得神經(jīng)元結(jié)構(gòu)填滿紅色，圖片標尺為20 μm。(D) 圖C區(qū)域放大圖片，箭頭指示樹突上的神經(jīng)元刺。

      因為上述的巨大技術(shù)優(yōu)勢和突破，非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)mIRage在生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)有廣泛的應(yīng)用前景和潛力，可應(yīng)用于諸如細胞學(xué)研究（蛋白質(zhì)、磷脂結(jié)構(gòu)分析，紅細胞、巨噬細胞成像等），臨床致病菌/病原微生物鑒定，癌癥診斷（細胞/組織），牙科/骨病變/眼科檢測，生物大分子損傷，生物組織識別，以及生物藥物檢測，法醫(yī)學(xué)等。

      近日，瑞典隆德大學(xué)的Klementieva教授團隊與美國PSC公司的Mustafa Kansiz博士合作，使用全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)在亞微米尺度上研究了淀粉樣蛋白沿著神經(jīng)突直到樹突棘的聚集行為（圖1B和C），這是以往的實驗技術(shù)手段所不可能實現(xiàn)的。在該研究中，他們使用了大腦皮層初級神經(jīng)元，這是因為它們易發(fā)生AD病變，且具有獨特的結(jié)構(gòu)。初級神經(jīng)元的這種形態(tài)特征使得可以在單個神經(jīng)元層面上來測試全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)的分辨率和準確性。首先，他們在反射模式下獲得了高質(zhì)量的紅外光譜，且不受米氏散射或基線失真等人為因素的干擾(圖2A,B)。值得注意的是，全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)其約為400 nm的橫向分辨率，使得他們能夠通過比較1740 cm^-1處的峰強度來檢測脂質(zhì)含量的差異，以及通過對比酰胺II (1540 cm⁻¹)與酰胺I特征峰強度(1654 cm⁻¹)的比值來比較氨基酸(蛋白質(zhì))的種類和數(shù)量上的差異(圖2C,D)。這是科學(xué)家們首次獲取單個樹突棘的高分辨率的化學(xué)圖像和紅外光譜，以往其它測試方法是無法做到的。 

圖2. 使用非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)mIRage觀察初級神經(jīng)元結(jié)構(gòu)。 (A) 在1650 cm^-1處獲得的神經(jīng)元的紅外圖像，顯示了蛋白質(zhì)的分布; (B)中對應(yīng)原始紅外光譜的位置用數(shù)字和圓點表示，圖片標尺為20 μm；（C）在1650 cm^-1處獲得的樹突的紅外圖像，數(shù)字表示D圖中獲得光譜的位置，圖片中標尺為20 μm；（D）在C圖中兩點處取的歸一化紅外光譜,體現(xiàn)了該方法的亞微米空間分辨率。紅色箭頭表示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化學(xué)變化。

      為了在亞細胞層面上定位神經(jīng)元中β片層結(jié)構(gòu)，作者對APP-KO神經(jīng)元進行了為時半小時的合成Aβ(1-42)處理（2×10−6 M），并使用非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)mIRage進行了化學(xué)結(jié)構(gòu)的成像分析（圖3A）。對Aβ處理后的APP-KO神經(jīng)元的紅外光譜進行分析證實，β片層結(jié)構(gòu)可以在亞細胞水平上進行分辨。有趣的是,純Aβ(1-42)纖維在1625 cm⁻¹位置處有特征的紅外峰，當加入到神經(jīng)元結(jié)構(gòu)中后，β片層結(jié)構(gòu)的特征峰移動到1630 cm^-1處，表明淀粉樣原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，可能是由于其與細胞蛋白和/或細胞膜發(fā)生相互作用導(dǎo)致的（圖3B, C）�；�于該發(fā)現(xiàn)，我們可以得出，在神經(jīng)元中的淀粉樣蛋白的構(gòu)型變化可能會引發(fā)阿爾茨海默癥進程中的不同機制。為進一步了解其形成機制，更多的方法學(xué)研究變得更加必要，如將非接觸式亞微米分辨紅外與免疫熒光顯微鏡結(jié)合起來，這種多模態(tài)成像模式可以在不同的細胞層面上更詳細分析特征蛋白的結(jié)構(gòu)變化，如前突觸或后突觸，囊泡(溶酶體或內(nèi)溶酶體)或其他細胞器。

圖3. 使用非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)Mirage觀察β片結(jié)構(gòu)在處理后的初級神經(jīng)元中的聚集行為。（A，B）APP-KO初級神經(jīng)元在1650和1630 cm^-1處的明場和光熱紅外成像，彩色標度表示光熱振幅的強度，從最小值(藍色)到最大值(紅色)，閾值為50%(以0為中心)，插圖為放大或疊加后的紅外成像圖，圖片標尺為20 μm；（C）神經(jīng)元中淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)在2×10−6 M Aβ(1-42) (紅色)處理或不處理(綠色)后分別對應(yīng)的紅外光譜。β片結(jié)構(gòu)對應(yīng)的特征紅外峰用紅色箭頭表示，光譜數(shù)據(jù)點間距為2 cm⁻¹，數(shù)據(jù)進行50次均一化處理。

      綜上所述，借助全新非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)mIRage，科學(xué)家成功首次揭示了初級神經(jīng)元的分子結(jié)構(gòu)，無需標記，且因為該技術(shù)是在非接觸模式下工作，不會對神經(jīng)元造成損傷，這在研究脆弱或粘性的物質(zhì)時顯得尤為重要。另外，該技術(shù)還能獲得亞微米尺度的紅外光譜，且不含由于背景失真或米氏散射造成的散射偽影。最新的技術(shù)進步表明，全新的非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)mIRage現(xiàn)在可以用來做活細胞成像,并保持相同的亞微米空間分辨率。在這種情況下，全新的非接觸式亞微米分辨紅外測量系統(tǒng)有望在β片層結(jié)構(gòu)在活神經(jīng)元的突觸附近的化學(xué)成像中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并提供一個新的機會來研究神經(jīng)毒性淀粉樣蛋白如何從一個患病的神經(jīng)元傳播到一個健康的神經(jīng)元，揭示阿爾茨海默癥的形成和發(fā)展機制。該工作發(fā)表在2020年的Advanced Sciences上（DOI: 10.1002/advs.201903004）。