PRIMO冷凍電鏡在標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞觀察的應(yīng)用

圖 1. 細(xì)胞在傳統(tǒng)電鏡網(wǎng)格中的定位和在 PRIMO 處理過的網(wǎng)格中的定位的對(duì)比【 2】：
 

 

 

 

顯示細(xì)胞核周圍的結(jié)構(gòu)， NPC：核孔復(fù)合物； MT：微管。

 

（三） 標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞模型

微圖案化已被證明是一個(gè)控制體外細(xì)胞粘附的有效方法。因此， 此技術(shù)被廣泛用于對(duì)細(xì)
胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)部組織進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（使之直接與外部的粘附條件相關(guān)聯(lián)）。
因?yàn)?PRIMO 的微圖案化操作可以在電鏡網(wǎng)格的網(wǎng)眼中自動(dòng)加上排列一致的微圖案，
PRIMO 已成為進(jìn)行均質(zhì)化和標(biāo)準(zhǔn)化冷凍電鏡（ cryo-ET）實(shí)驗(yàn)的工具。
進(jìn)一步而言，在冷凍電鏡觀察細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中使用 PRIMO 進(jìn)行微圖案化，有助于精準(zhǔn)地針
對(duì)特定的細(xì)胞內(nèi)部元素進(jìn)行成像觀察，而用其他成像方法很難做到【 1】。
 

圖 3. 微圖案化可控制細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)【 2】：
（ a 圖）： RPE1 LifeAct-GFP 細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白微絲組織的活細(xì)胞共聚焦顯微圖像，該細(xì)胞
生長在 PRIMO 制造的微圖案上（金網(wǎng)眼， SiO2 膜 R1/4）。黃色箭頭：肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維（ actin
stress fibers）。藍(lán)色箭頭：由 putative bundles 組成的肌動(dòng)蛋白環(huán)（ actin rings）。
（ h-i 圖）：一個(gè)生長在十字弓形狀的微圖案（黃色）上的細(xì)胞的掃描電鏡（ SEM）圖，微
圖案由 PRIMO 制造。黃色長方體表示準(zhǔn)備 milling 的微圖案。
P1 和 P2 方塊：圖 4 中（ j 圖）和（ k 圖）的斷層掃描切片（ tomographic slice）的位置。


圖 4. （ j-k 圖）：冷凍電鏡圖像：分別是（圖 3， h 圖）中 P1 和 P2 兩個(gè)位置的斷層掃描切
片。
根據(jù)十字弓形狀的 RPE1 細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白圖譜（ actin map），在預(yù)期的位置發(fā)現(xiàn)了大致等同
于肌動(dòng)蛋白橫向�。� actin transverse arcs）（與細(xì)胞邊緣平行但有一定距離）的肌動(dòng)蛋
白束（ actin bundles）和在（圖 3， a 圖）中顯示的內(nèi)部應(yīng)力纖維（ internal stress fibers）
【 2】。

（四） 電鏡網(wǎng)格表面無損傷

因?yàn)?PRIMO 是無掩模和非接觸式光刻系統(tǒng)，它可以將您要的微圖案用 UV 光投射到電鏡
網(wǎng)格的表面，而不會(huì)損傷網(wǎng)格的完整性。


圖 5. 用 PRIMO 系統(tǒng)對(duì)電鏡網(wǎng)格進(jìn)行無掩模的光照?qǐng)D案化（ photopatterning）操作【 3】：
在金電鏡網(wǎng)格上加上一層多孔碳膜，在多孔碳膜上包裹一層防污涂層（ PLL-g-PEG，聚 L 賴
氨酸-g-聚乙二醇），阻礙蛋白質(zhì)粘附。加入 PLPP 光引發(fā)劑，通過 PRIMO 的非接觸式、無掩
模的光刻技術(shù)，用 UV 光將圖案投射到碳膜上，防污涂層被降解，蝕刻出微圖案， ECM 蛋白
可粘附在蝕刻出的微圖案上，細(xì)胞再粘附在蛋白上。整個(gè)過程對(duì)電鏡網(wǎng)格無損傷。


圖 6. 左側(cè)（ a 圖）：用 PRIMO 無掩模光照?qǐng)D案法（ photopatterning）得到的，在多孔碳電
鏡網(wǎng)格中的 ECM 蛋白微圖案。電鏡網(wǎng)格為 200 目的金格柵條，比例尺為 50µm。
右側(cè)（ A-I 圖）：上皮 PtK1 細(xì)胞，被限制在電鏡網(wǎng)格中的羅丹明-纖維連接蛋白（紅色）組
成的微圖案上，該微圖案由 PRIMO 無掩模光照?qǐng)D案法得到。比例尺為 10µm。【 3】
（五） 什么是 PRIMO？

5.1 PRIMO 的原理

法國 Alveole PRIMO “ 定制化細(xì)胞微環(huán)境制備系統(tǒng)” 是創(chuàng)新性定制細(xì)胞模型的工具，
能在微米級(jí)別的尺度下，以具有超高靈活度和再現(xiàn)性的生物工程手段實(shí)現(xiàn)體外微環(huán)境的定
制，同時(shí)可對(duì)其機(jī)械力學(xué)和生化特性進(jìn)行設(shè)計(jì)微調(diào)。


圖 7. 左圖：選擇電腦中任意一張圖案，在 LEONARDO 軟件作用下，用 PRIMO 進(jìn)行非接觸式、
無掩模 UV 投射和蝕刻。 PRIMO 模塊和大多數(shù)倒置顯微鏡兼容。右圖： PRIMO 通過控制 DMD
（ Digital Micromirror Device），即 DLP chip 的微型鏡片的開合狀態(tài)，控制投射在細(xì)胞
基質(zhì)上的 UV 光的照射強(qiáng)度、照射時(shí)間和照射區(qū)域，按照?qǐng)D案進(jìn)行靈活蝕刻【 4】。
PRIMO 的微圖案法（ Micropatterning）的實(shí)驗(yàn)原理可參考： 生物建模的黑科技——快
捷精準(zhǔn)的“定制化細(xì)胞微環(huán)境制備系統(tǒng)”（上）。

5.2 PRIMO 的主要特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)【 4】：

⚫ 無掩模： 非接觸式、無掩模 UV 投射成像（波長λ =375nm），可靈活控制 UV 的強(qiáng)度、照
射時(shí)間、區(qū)域；
⚫ 自動(dòng)化： 全自動(dòng)快速定制，可針對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行快速優(yōu)化；
⚫ 高靈活性： 可按照任意圖案去構(gòu)建您的基質(zhì)和/或使其功能化，不限圖案的大小和復(fù)雜
程度，生成不同的細(xì)胞模型；
⚫ 多樣性/兼容性： 適用于常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，基質(zhì)可為平面或有微結(jié)構(gòu)，可硬可軟，
如：玻璃蓋玻片、塑料培養(yǎng)皿、聚二甲基硅氧烷（ PDMS）、聚苯乙烯、水凝膠（ PEG 丙
烯酸酯、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂、基質(zhì)膠）、光刻膠，等；
⚫ 常 用 蛋 白 ： 我 們 的 客 戶 日 常 使 用 超 過 10 種 的 各 類 蛋 白 ： Fibrinogen-488,
Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647,
PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初級(jí)和次級(jí)抗體，等；
⚫ 高分辨率： 全視野分辨率為 1.2µm（ 500× 300µm ， 20 倍物鏡）；
⚫ 多層次： 可蝕刻 256 個(gè)灰階層次，粘附不同密度層次的蛋白；
⚫ 多種蛋白： 可應(yīng)用 3 種不同蛋白（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求）；
⚫ 自動(dòng)對(duì)齊： 自動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)和圖案定位，可自動(dòng)對(duì)齊于微結(jié)構(gòu)或者微圖案上；
⚫ 速度快： 蝕刻 500× 300µm 圖案， 20 倍物鏡，僅需 30s。

5.3 PRIMO 的應(yīng)用領(lǐng)域

PRIMO 強(qiáng)大的生物建模能力和對(duì)細(xì)胞微環(huán)境的控制，可以為多種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)帶來全新
的、突破性視角，可用于研究細(xì)胞遷移/趨觸性、細(xì)胞黏附、 2D/3D 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)、細(xì)胞
球培養(yǎng)、生物力學(xué)、組織工程、微流體芯片，等多個(gè)領(lǐng)域【 4】 。

（六） 附錄

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參考文獻(xiàn)：
【 1】 Alveole 的官網(wǎng)：
https://www.alveolelab.com/applications/cryo-em-grid-micropatterning/
【 2】 M. Toro-Nahuelpan et.al., Tailoring cryo-electron microscopy grids by
photo-micropatterning for in-cell structural studies, Nature Methods, 2019,
https://doi.org/10.1038/s41592-019-0630-5.
【 3】 L. Engel et.al., Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell
cryogenic electron microscopy studies, Journal of Micromechanics and
Microengineering, 29 (2019) 115018 (9pp),https://doi.org/10.1088/1361-6439/ab419a
【 4】 Alveole 的官網(wǎng)： https://www.alveolelab.com/