推開(kāi)GPCR靶點(diǎn)與代謝性疾病研究的敲門磚-動(dòng)物模型

 基因編輯技術(shù)最具代表性的就是在人類疾病動(dòng)物模型制備方面的應(yīng)用。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，代謝性疾病的發(fā)病率逐年增高，其中心血管疾病導(dǎo)致的死亡占我國(guó)居民全部死因的40%以上，死亡率居于首位^[1]。通過(guò)構(gòu)建包括心血管疾病、糖尿病等代謝領(lǐng)域基因編輯小鼠模型，并進(jìn)行多種深入研究，可以找到相關(guān)疾病的潛在治療靶點(diǎn)，研究靶點(diǎn)作用機(jī)制，推進(jìn)藥物研發(fā)領(lǐng)域的發(fā)展。

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）家族，作為最大的藥物靶標(biāo)蛋白家族，家族成員800多個(gè)且分布廣泛，與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程有所關(guān)聯(lián)。GPCR藥物研發(fā)具有非常重要的價(jià)值，靶向GPCR靶點(diǎn)藥物總計(jì)475種獲批，涵蓋108個(gè)GPCR靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)創(chuàng)新的藥物變得的愈發(fā)重要^[2]。GPCR家族的基因編輯動(dòng)物模型研究也為開(kāi)發(fā)創(chuàng)新靶點(diǎn)藥物提供了契機(jī)。本篇內(nèi)容小編為大家分享GCPR靶點(diǎn)基因敲除小鼠在部分代謝疾病研究中的應(yīng)用。
 

 

圖1. G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路^[3]

 

GPCR靶點(diǎn)基因編輯小鼠模型與代謝疾病相關(guān)研究

 

心血管疾病

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種復(fù)雜的慢性炎癥疾病，是大多數(shù)心血管疾病 (Cardiovascular diseases, CVD) 的根本原因，它的炎癥過(guò)程由免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)及其隨后的反應(yīng)所促進(jìn)。細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)由多種炎癥介質(zhì)協(xié)調(diào)，它們相互作用、結(jié)合并誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)。GPCRs 成為識(shí)別這些介質(zhì)的重要參與者，由于其介導(dǎo)的功能效應(yīng)種類繁多而成為有前景的藥理學(xué)靶點(diǎn)，它們與許多在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中起關(guān)鍵作用的過(guò)程有關(guān)。Chemerin受體23（ChemR23，也稱為CMKLR1）是一種表達(dá)在免疫細(xì)胞亞型（如樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）表面的A類GPCR蛋白。ChemR23可維持M1巨噬細(xì)胞表型，刺激pDC遷移和浸潤(rùn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊（圖2）。

 

圖2. 各種 GPCR 參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的示意圖^[4]

近期有研究采用Apoe^-/-ChemR23^-/-小鼠模型進(jìn)一步證明Erv1/Chemr23 的靶向缺失與巨噬細(xì)胞中促動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)、氧化低密度脂蛋白攝取增加、吞噬作用減少以及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小和壞死核心形成增加相關(guān)。表明ChemR23具有一定的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用（圖3）^[5]。
 

 

圖3. Apoe^-/-xErv1/ChemR23^-/-小鼠增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化，促進(jìn)斑塊成分和基因表達(dá)的改變

 

與心血管疾病相關(guān)的GPCR成員主要分布于A類家族的α亞類，如人體最重要的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一，血管緊張素系統(tǒng)（RAAS）中的AT1R、AT2R以及Mas-R。血管緊張素II（AngII）1 型受體（AT1R）可自發(fā)激活。通過(guò)膜環(huán)境、相互作用蛋白、受體自身抗體和單核苷酸多態(tài)性（SNP）等增加AT1R表達(dá)的途徑，可以在 AngII 缺失的情況下，增加G蛋白信號(hào)^[6]。

Yasuda^[7]等人首次證明野生型hAT1R表達(dá)的心臟特異性上調(diào)會(huì)導(dǎo)致自發(fā)性收縮功能障礙和心腔擴(kuò)張，并伴隨遺傳性血管緊張素原（Agt）缺陷小鼠的嚴(yán)重間質(zhì)纖維化，通常認(rèn)為 AngII 與 hAT1R 結(jié)合可啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。為了闡明AngII非依賴性AT1R激活在心臟中的致病作用，將在α-肌球蛋白重鏈 (MHC) 啟動(dòng)子控制下過(guò)表達(dá)hAT1R的轉(zhuǎn)基因小鼠與Agt敲除小鼠雜交，建立 AT1^Tg-Agt^KO 雜交小鼠，其中AngII的產(chǎn)生存在遺傳缺陷。在AT1^Tg 親代小鼠中，hAT1R 的過(guò)度表達(dá)在內(nèi)源性 AngII 水平存在的情況下可誘導(dǎo)心臟重塑。具有內(nèi)源性 AT1R 表達(dá)水平的 Agt 缺陷小鼠未出現(xiàn)病理學(xué)變化。當(dāng) AngII 生成受到基因抑制時(shí)，由于天然 hAT1R 的過(guò)表達(dá)，體內(nèi)組成性活性的增強(qiáng)可能導(dǎo)致心臟異常^[8]。
在各種激素、細(xì)胞因子、炎癥或代謝應(yīng)激下，心臟和血管中AT1R的上調(diào)將成比例地增強(qiáng) AT1R 的組成活性，并加速這些組織中的疾病發(fā)展。
 

 

圖4. 組成性活性 AT1R 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制^[6]

 

目前研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種疾病基礎(chǔ)上的GPCR突變，并開(kāi)發(fā)了表達(dá)這些突變的轉(zhuǎn)基因小鼠及相關(guān)GPCR的基因編輯小鼠作為人類疾病的動(dòng)物模型，證實(shí)了GPCR 家族為心血管疾病的治療提供了新的視角。

2型糖尿病
 

2型糖尿�。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種復(fù)雜的多基因疾病，其病人存在著明顯的胰島素抵抗，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷是產(chǎn)生胰島素抵抗的重要機(jī)理，同時(shí)也影響胰島素的分泌。隨著基因技術(shù)的快速發(fā)展，利用基因敲除技術(shù)探其在產(chǎn)生胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷中的作用已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)^[9]。
 

 

圖5. GLP-1的生理作用^[10]

 

人胰高血糖素樣肽-1受體（GLP-1受體，GLP-1R）是GPCR家族B類家族的一員，分布于產(chǎn)生胰島素的胰腺細(xì)胞表面，GLP-1與其結(jié)合后激活腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生cAMP，同時(shí)增強(qiáng)葡萄糖刺激的胰島素分泌。GLP-1促進(jìn)β細(xì)胞胰島素分泌可通過(guò)兩種方式，其一是通過(guò)蛋白激酶A(PKA)信號(hào)途徑磷酸化分泌顆粒相關(guān)蛋白質(zhì)，以促進(jìn)Ca2+依賴的胰島素胞外分泌；另一作用是通過(guò)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子(cAMP-regulated guanine nucleotide exchange factor)介導(dǎo)^[11]。
 

 

圖6. GLP-1促進(jìn)胰島素分泌的機(jī)制^[11]

 

GLP-1通過(guò)GLP-1R發(fā)揮作用，它可刺激胰腺產(chǎn)生胰島素并抑制胰高糖素的分泌，從而發(fā)揮其對(duì)胰島β細(xì)胞的增殖及抗凋亡作用，可通過(guò)減緩胃排空速度調(diào)節(jié)血糖以保持動(dòng)態(tài)平衡。研究表明GLP-1R敲除小鼠可免受高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗，抑制胰高血糖素分泌和延遲胃排空，從而減少餐后血糖波動(dòng)^[12]。此外還有研究表明GLP-1與骨代謝也有密不可分的聯(lián)系，可通過(guò)降鈣素依賴途徑抑制破骨細(xì)胞，增加骨量，GLP-1R在成骨細(xì)胞前體表達(dá)，GLP-1R基因敲除小鼠還可引起骨質(zhì)疏松癥。因此，糖尿病與骨代謝具有一定的相關(guān)性^[13]。

GLP-1的發(fā)現(xiàn)及功能研究為糖尿病治療藥物的開(kāi)發(fā)提供了新的策略，目前已有幾類靶向于GLP1R的多肽類藥物已獲批用于2型糖尿病的治療，包括Exenatide、Liraglutide、Lixisenatide、Albiglutide及Dulaglutide等^[14]�？诜�型靶向GLP1R的多肽藥物和小分子藥物正處于臨床試驗(yàn)中。

 

小結(jié)
 

基因編輯技術(shù)的發(fā)展和動(dòng)物模型的開(kāi)發(fā)，為代謝等領(lǐng)域疾病的早期發(fā)現(xiàn)及治療提供了強(qiáng)有力的手段，充分利用這些技術(shù)將進(jìn)一步的研究疾病潛在的治療靶點(diǎn)與進(jìn)展。
雖然目前僅有2例靶向GPCR的單克隆抗體獲得FDA批準(zhǔn)，但研究熱度依然不減。GPCR家族蛋白成員具有7次跨膜，以及其天然的低表達(dá)率的特點(diǎn)使得可溶性GPCR抗原難以制備，抗體篩選困難。針對(duì)這類靶點(diǎn)采用基因敲除的全人抗體小鼠（RenMab+KO）進(jìn)行抗體篩選，利用細(xì)胞系或多肽環(huán)作為抗原，將大大提高抗體篩選效率，推進(jìn)藥物開(kāi)發(fā)進(jìn)展。

 

參考資料

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[2] Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., & Gloriam, D. E. (2017). Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery, 16(12), 829–842.doi:10.1038/nrd.2017.178

[3] Dorsam, R. T., & Gutkind, J. S. (2007). G-protein-coupled receptors and cancer. Nature Reviews Cancer, 7(2), 79–94

[4] Emiel P. C. van der Vorst，Linsey J. F. Peters，et al．G-Protein Coupled Receptor Targeting on Myeloid Cells in Atherosclerosis，F(xiàn)ront. Pharmacol., 22 May 2019

[5] Laguna-Fernandez, A., Checa, A., Carracedo, M., Artiach, G., Petri, M. H., Baumgartner, R., … Bäck, M. (2018). ERV1/ChemR23 Signaling Protects from Atherosclerosis by Modifying oxLDL Uptake and Phagocytosis in Macrophages. Circulation, CIRCULATIONAHA.117.032801.

[6] Sadashiva S. Karnik，Hamiyet Unal. Angiotensin II Receptor-Induced Cardiac Remodeling in Mice Without Angiotensin II. Comment on Hypertension. 2012 Mar;59(3):627-33.

[7] Yasuda N, Akazawa H, Ito K, Shimizu I, Kudo-Sakamoto Y, Yabumoto C, Yano M, Yamamoto R, Ozasa Y, Minamino T, Naito AT, Oka T, Shiojima I, Tamura K, Umemura S, Nemer M, Komuro I. Agonist-independent constitutive activity of angiotensin II receptor promotes cardiac remodeling in mice. Hypertension. 2012;59

[8] Paradis P, Dali-Youcef N, Paradis FW, Thibault G, Nemer M. Overexpression of angiotensin II type I receptor in cardiomyocytes induces cardiac hypertrophy and remodeling. Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97:931–936

[9] 周麗斌. 基因敲除技術(shù)在2型糖尿病研究中的應(yīng)用．國(guó)外醫(yī)學(xué)：內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè)，2002，3：177一180．

[10] https://en.wikipedia.org/wiki/Glucagon-like_peptide-1

[11] 閔媛婷，盛德喬. GLP-1與2型糖尿病的研究進(jìn)展. 生命的化學(xué), 2015, 35(6): 751-756

[12] Julio E Ayala 1，Deanna P Bracy，eta1. Glucagon-like peptide-1 Receptor Knockout Mice Are Protected From High-Fat Diet-Induced Insulin Resistance[J].Endocrinology, 151 (10), 4678-87

[13] 王滌非. 胰島素受體底物-1在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用研究. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，2005.

[14] https://med.sina.com/article_detail_103_2_37458.html