技術(shù)強(qiáng)則藥物強(qiáng)-單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)

如今,單克隆抗體藥物以其獨(dú)特的作用機(jī)制及高效性,在腫瘤和自身免疫疾病的治療中發(fā)揮了不可估量的作用,成為全球的研發(fā)熱點(diǎn)，目前已有2400個(gè)單克隆抗體藥物處于研發(fā)及商業(yè)化階段。
 

1975年雜交瘤技術(shù)問(wèn)世^[1]。1986年鼠源單克隆抗體藥物Muromonab的上市拉開(kāi)了單克隆抗體發(fā)展的序幕。隨后的50年，單克隆抗體藥物經(jīng)歷了嵌合抗體-人源化抗體--全人源抗體四個(gè)階段，產(chǎn)生了抗體偶聯(lián)藥物、抗體融合蛋白、單域抗體等多種新型抗體藥物，標(biāo)志著免疫療法黃金時(shí)代的開(kāi)啟^[2]。單克隆抗體藥物的推陳出新歸根于單克隆抗體技術(shù)的不斷發(fā)展與創(chuàng)新。目前應(yīng)用的抗體技術(shù)有：雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、天然全人源庫(kù)技術(shù)和單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)。

單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)原理

單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)^[3]是近年來(lái)新發(fā)展的一類快速制備單克隆抗體的技術(shù)，是根據(jù)每一個(gè)B細(xì)胞只含有一個(gè)功能性重鏈可變區(qū)DNA序列和一個(gè)輕鏈可變區(qū)DNA序列，以及每一個(gè)B細(xì)胞只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，從免疫動(dòng)物組織或外周血中分離抗原特異性B細(xì)胞，通過(guò)單細(xì)胞PCR技術(shù)從單個(gè)抗體分泌B細(xì)胞中擴(kuò)增IgG重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，然后在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)獲得具有生物活性的單克隆抗體。這種方法保留了重鏈和輕鏈可變區(qū)的天然配對(duì)，具有基因多樣性好、效率高、全天然源性的特點(diǎn)，也成為了目前快速開(kāi)發(fā)針對(duì)抗病毒感染性疾病抗體的重要策略。
 

 單個(gè)B細(xì)胞抗體制備過(guò)程

圖1  單個(gè)B淋巴細(xì)胞抗體制備過(guò)程^[4]
 

 1. 鑒定和分離單個(gè)B細(xì)胞
 

1）溶血斑塊技術(shù)分選B細(xì)胞

溶血斑塊技術(shù)原理^[5]是抗原與抗體反應(yīng)后，在補(bǔ)體作用下能使紅細(xì)胞裂解形成溶血斑塊，進(jìn)而通過(guò)顯微技術(shù)篩選和分離抗原特異性B細(xì)胞。該方法有點(diǎn)：方便、快捷、特異性好；缺點(diǎn)：紅細(xì)胞容易受到溫度、滲透壓、酶等多方面影響，且溶血斑塊技術(shù)分離的B細(xì)胞往往不能進(jìn)行高通量分析和活細(xì)胞增殖。

 

圖2  克隆單細(xì)胞免疫球蛋白V_H和V_LcDNAs產(chǎn)生特異性抗體的策略^[5]

 

2）MACS法（磁珠分選法)分選B細(xì)胞
 

原理是基于抗原抗體結(jié)合的特異性，B細(xì)胞表面分子與包被有特異性抗體的磁珠相結(jié)合，形成表面分子-抗體-磁珠復(fù)合物，在外加磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，不能與特異性抗體相結(jié)合的細(xì)胞由于沒(méi)有吸附磁珠，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離^[6]。該方法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、重復(fù)性好；缺點(diǎn)：用到的抗體種類較多、對(duì)磁珠與磁珠柱的質(zhì)量要求較高、費(fèi)用較高。該方法可以和其它分離方法配合使用。
 

 

3）微雕刻和ISAAC方法分選B細(xì)胞

微雕刻技術(shù)原理^[7]是基于軟光刻微陣列芯片識(shí)別、克隆抗原特異性B細(xì)胞的方法。通過(guò)刺激多克隆B細(xì)胞，并將其逐個(gè)分布到芯片孔內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)產(chǎn)生抗體，然后將改芯片孔內(nèi)抗體轉(zhuǎn)印至相應(yīng)的蛋白芯片，通過(guò)與目標(biāo)抗原反應(yīng)后，再與熒光抗體反應(yīng)，最后根據(jù)熒光抗體染色結(jié)果，通過(guò)顯微操作將分泌特異性抗體的B細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行后續(xù)克隆操作或抗體基因擴(kuò)增。ISAAC(芯片免疫斑點(diǎn)微陣列測(cè)定)^[8]，是微雕法的延伸，是用包被于芯片表面的抗IgG抗體替代了抗體轉(zhuǎn)移過(guò)程，并且能在同一塊芯片上研究針對(duì)多種不同目標(biāo)抗原的特異性抗體，并分離多種抗原特異性B細(xì)胞。這兩種方法優(yōu)點(diǎn)：高通量、高特異性、高靈敏度；缺點(diǎn)：芯片陣列的構(gòu)建價(jià)格較高、芯片上抗體包被比較復(fù)雜。
 

圖4  ISAAC技術(shù)檢測(cè)單個(gè)抗體分泌細(xì)胞^[8]
 

4）FACS法分選B細(xì)胞
 

FACS法原理^[9]是基于抗原抗體的特異性反應(yīng)，利用熒光素標(biāo)記的B細(xì)胞表面分子的抗體，以及標(biāo)記的特異性抗原，通過(guò)多色流式分析與分選的方法，篩選抗原特異性B細(xì)胞。FACS分選可以將單個(gè)抗原特異性B細(xì)胞分選入細(xì)胞培養(yǎng)板的單孔中，直接進(jìn)行抗體基因的擴(kuò)增與測(cè)定。該技術(shù)是目前應(yīng)用較廣泛的一種方法。優(yōu)點(diǎn)：分離B細(xì)胞快速、準(zhǔn)確、大量、多參數(shù)同時(shí)分析；缺點(diǎn)：費(fèi)用高、通電磁場(chǎng)對(duì)細(xì)胞有一定損傷，會(huì)影響細(xì)胞活性。

 

(A) 傳感器的流體力學(xué)聚焦和振動(dòng)產(chǎn)生的液流斷裂成液滴，其含有已被熒光標(biāo)記抗體染色的細(xì)胞。(B) 通過(guò)激光掃描液滴，并對(duì)信號(hào)進(jìn)行處理以給出“分類決策”（如果液滴含有綠色熒光細(xì)胞，則將進(jìn)行充電并相應(yīng)分類）。(C)當(dāng)液滴脫落時(shí)，施加電荷。(D) 含有目標(biāo)細(xì)胞的帶電液滴由靜電場(chǎng)引導(dǎo)進(jìn)入指定的收集管完成分類。

 

5）微流控技術(shù)分選B細(xì)胞
 

結(jié)合微流控設(shè)備和芯片的技術(shù)是目前主流的商業(yè)化單B細(xì)胞平臺(tái)。BLI公司（Berkeley Lights，Inc）的Beacon單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)受到多家大型藥企的青睞。Beacon平臺(tái)是通過(guò)微流控系統(tǒng)將分泌抗原特異性抗體的細(xì)胞輸送到芯片部位，并通過(guò)光電定位技術(shù)OEP將單細(xì)胞分離到芯片的各個(gè)小室中。而后采用基于磁珠的雙色熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢各細(xì)胞的分泌物，分泌抗原特異性抗體的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，被儀器識(shí)別，單個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)OEP技術(shù)被導(dǎo)出輸送到96孔板中，進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)序、表達(dá)。該系統(tǒng)集單細(xì)胞分選和檢測(cè)及分析為一體，靈敏度和準(zhǔn)確度高。

 

 

2. 擴(kuò)增和克隆抗體基因

通常通過(guò)FACS法分離抗原特異性B細(xì)胞后，將其分選至含裂解液的96孔板中，裂解B細(xì)胞并釋放細(xì)胞內(nèi)RNA。隨后通過(guò)RT-PCR、巢式PCR得到抗原特異性單個(gè)B細(xì)胞抗體可變區(qū)基因。

3. 表達(dá)、篩選和鑒定抗原特異性抗體

FACS分選的單個(gè)B細(xì)胞抗體基因擴(kuò)增、載體構(gòu)建、抗體表達(dá)及活性驗(yàn)證是必要步驟。表達(dá)系統(tǒng)常用的是原核表達(dá)系統(tǒng)（例如大腸桿菌）或真核表達(dá)系統(tǒng)。在大腸桿菌中，通常表達(dá)抗體的抗原結(jié)合片段（Fab),而在哺乳動(dòng)物中，可以表達(dá)完整的IgG分子�？贵w生物活性驗(yàn)證主要通過(guò)ELISA、間接免疫熒光、中和試驗(yàn)等常規(guī)方法來(lái)驗(yàn)證；除此之外，還可以通過(guò)流式分析法、免疫共沉淀、空斑法、空斑減少中和試驗(yàn)等方法來(lái)驗(yàn)證。

 

單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)應(yīng)用

單個(gè) B 細(xì)胞抗體技術(shù)制備的單克隆抗體在抗病毒治療、神經(jīng)性疾病治療、免疫疾病治療等方面顯出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和良好的應(yīng)用前景。

1. 抗病毒治療應(yīng)用

許多單B細(xì)胞抗體對(duì)病毒的治療正在臨床試驗(yàn)階段中。HIV引起獲得性免疫缺陷綜合征，全球已有6390萬(wàn)人感染，通過(guò)單B細(xì)胞技術(shù)已獲得5種抗HIV包膜蛋白的抗體(3BNC117; 10-1074; VRC01; PGT121；N6)正在臨床I/II 期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)價(jià)。利用單個(gè)B細(xì)胞抗體技術(shù)，從治愈后的患者血液中分選抗體分泌的單個(gè)B細(xì)胞，快速鑒定和表達(dá)抗體基因，特別是對(duì)于新型病毒的治療和預(yù)防有很大幫助。

2. 神經(jīng)性疾病治療應(yīng)用

偏頭痛是全球第三大最常見(jiàn)疾病和第六大致殘性疾病，這是一種常見(jiàn)的慢性神經(jīng)血管性疾病。2020年2月21日，Lundbeck宣布其偏頭疼藥物Vyepti（eptinezumab，兔抗體藥物）獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。Vyepti是由單B細(xì)胞技術(shù)制備的兔抗體藥物，靶向結(jié)合降鈣素相關(guān)基因肽（CGRP）配體，阻斷其對(duì)受體的結(jié)合作用。其II期臨床結(jié)果顯示許多患者的偏頭痛天數(shù)可以減少75%。此外，該公司的另一種偏頭疼藥物ALD1910正處于臨床前研究階段。

3. 免疫疾病治療應(yīng)用

單個(gè) B 細(xì)胞抗體制備技術(shù)能夠分離到人體內(nèi)任意時(shí)期的B細(xì)胞，使得詳細(xì)深入地研究人體免疫系統(tǒng)各個(gè)階段功能和機(jī)理成為可能。對(duì)于自身免疫性疾病和其他免疫系統(tǒng)疾病治療抗體研究有良好的應(yīng)用前景。
 

雖然，單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)具有效率高、全人源、基因多樣性更豐富等優(yōu)勢(shì)。但2020年之前的10年中FDA尚未批準(zhǔn)任何該方法制備的抗體藥物，且仍有一些不足，還有要不斷克服和完善。全人抗體開(kāi)發(fā)成為近期藥物開(kāi)發(fā)的趨勢(shì)，多種抗體技術(shù)的結(jié)合也將產(chǎn)生更多有效藥物，在醫(yī)藥領(lǐng)域極具前景。
 

百奧賽圖引入Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)，將分離和鑒定產(chǎn)生抗體的原代B細(xì)胞的工作在不到一天的時(shí)間內(nèi)完成，結(jié)合自主開(kāi)發(fā)的全人抗體RenMab小鼠，能夠快速高效獲得全人抗體，建立一站式抗體藥物開(kāi)發(fā)平臺(tái)。百奧賽圖將通過(guò)“千鼠萬(wàn)抗”計(jì)劃,打造全球創(chuàng)新藥物發(fā)源地，助力合作伙伴加快藥物研發(fā)進(jìn)程。

 

圖 7  百奧賽圖RenMab小鼠+Beacon平臺(tái)加速抗體發(fā)現(xiàn)過(guò)程

 

參考文獻(xiàn)
 

[1] Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J]. Nature, 1975, 256(5517):495-497.

[2] 高倩, 江洪, 葉茂, 等. 全球單克隆抗體藥物研發(fā)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2019(3):111-119.

[3] 向軍儉, 童吉宇, 王宏. 抗體技術(shù)研究進(jìn)展(1):人源抗體技術(shù)[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版, 2012(05):92-98.

[4] 呂信萍, 吳靜, 陳京濤. 單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)及其在肝臟疾病中的應(yīng)用[J]. 臨床肝膽病雜志, 2015, 31(12):2104-2109.

[5] Babcook J.S., Leslie K.B., Olsen O.A., et al. A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes. [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996，93(15):7843-7848.

[6] Bosio A., Huppert V., Donath S., et al. Isolation and Enrichment of Stem Cells. Engineering of Stem Cells, [J]. advances in biochemical engineering/biotechnology, 2009, 114(114):23.

[7] Love J.C., Ronan J.L., Grotenbreg G.M., et al. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies[J]. Nature Biotechnology, 2006, 24(6):703-707.

[8] Jin A., Ozawa T., Tajiri K., et al. A rapid and efficient single-cell manipulation method for screening antigen-specific antibody–secreting cells from human peripheral blood[J]. Nature Medicine, 2009, 15(9):1088-1092.

[9] Fitzgerald V., Leonard P., et al. Single cell screening approaches for antibody discovery[J]. Methods, 2016(1-9).

[10] 遲象陽(yáng), 于常明，陳薇. 單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)及應(yīng)用[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2012, 28(6):651-660.

[11] http://commercial.dxy.cn/article/680978?trace=hot
 

掃碼關(guān)注百奧賽圖了解更多資訊哦