微生物監(jiān)測在生物安全實驗室中的應(yīng)用

17年前，SARS冠狀病毒引起的“非典”事件，回想起來，仍讓人心有余悸。17年后，武漢又爆發(fā)了轟動全球的新型冠狀病毒肺炎感染事件。1月12日，世界衛(wèi)生組織（WHO）正式將造成武漢肺炎疫情的新型冠狀病毒命名為2019-nCov。



2月8日下午，國務(wù)院應(yīng)對新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制成員現(xiàn)決定，將新型冠狀病毒感染的肺炎暫命名為“新型冠狀病毒肺炎”，英文名為“Novel coronavirus pneumonia”，簡稱“新冠肺炎”，英文簡稱NCP。

2月11日晚，國際病毒分類委員會的冠狀病毒研究小組（CSG）在醫(yī)學(xué)類預(yù)印本發(fā)布平臺 medRxiv 發(fā)表最新關(guān)于新型冠狀病毒命名的論文，宣布新型冠病毒“2019-CoV”的正式分類名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。另外，在該篇論文發(fā)布前兩個小時，世界衛(wèi)生組織（WHO）也將由新型冠狀病毒所致的疾病，正式命名為“COVID-19”。
時值春節(jié)假期期間，武漢新型冠狀病毒肺炎感染事件為中國最重要的節(jié)日蒙上了一層陰影；而億萬人東西南北流動的春運，又令肺炎感染事件雪上加霜，也給全國的交通、醫(yī)院和疾控系統(tǒng)等帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

中國疾病預(yù)防控制中心表示，本次發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒與SARS和MERS冠狀病毒雖同屬于冠狀病毒這一大家族，但基因進(jìn)化分析顯示它們分屬于不同的亞群分支，它不是SARS，也不是MERS病毒，它們的病毒基因序列差異比較大。冠狀病毒在自然界中非常常見，分為很多類型，所造成的危害差別也很大，引起武漢病毒性肺炎疫情的病原體為一種新的冠狀病毒，有別于SARS病毒。

中國疾病預(yù)防控制中心和各省市疾病預(yù)防控制中心（簡稱疾控中心）承擔(dān)著全國和各個省市的疾病預(yù)防與控制、應(yīng)急預(yù)警與處置、疫情收集與報告、監(jiān)測檢驗與評價、健康教育與促進(jìn)、應(yīng)用研究與指導(dǎo)、業(yè)務(wù)培訓(xùn)與保障、技術(shù)管理與服務(wù)等政府對社會的疾病控制職能。

疾控中心的建設(shè)要符合我國現(xiàn)行的生物安全實驗室各項標(biāo)準(zhǔn)，目前國際上依據(jù)實驗室所處理對象的生物危險程度，把生物安全實驗室分為四級：一級對生物安全隔離的要求最低，四級最高。我國目前有兩個四級生物安全實驗室：湖北武漢BSL-4病毒實驗室（中國科學(xué)院武漢國家生物安全實驗室 ）和國家動物疫病防控高級別生物安全實驗室（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所）。


而三級生物安全實驗室，即BSL-3實驗室，是國家及幾乎所有省和直轄市疾控系統(tǒng)中最高等級的生物安全實驗室，在疾病預(yù)防與控制、應(yīng)急預(yù)警與處置、監(jiān)測檢驗與評價等工作中發(fā)揮著巨大的作用。BSL-3實驗室相對于BSL-1實驗室和BSL-2實驗室，主要是進(jìn)行特殊的診斷和研究，脈動真空滅菌柜和過氧化氫
空間滅菌器等都是必不可少的安全設(shè)施。


本次新型冠狀病毒需要在BSL-3實驗室及以上實驗室才能進(jìn)行實驗，所以有極高的無菌要求。傳遞進(jìn)出的物品都要滅菌，常見待滅菌物質(zhì)有：固體（如金屬器械、實驗室設(shè)備、實驗室玻璃器具等），多孔物質(zhì)（如衣物、試管等），開口的液體容器（如實驗室內(nèi)裝滿水溶液的三角瓶等），生物廢棄物（如帶菌的培養(yǎng)基、動物尸體）等。

而如何保證脈動真空滅菌柜滅菌效果是至關(guān)重要的，因為BSL-3實驗室實驗操作過程所產(chǎn)生的固體或少量液體廢棄物中含有病毒和細(xì)菌等有害物質(zhì)，若病毒等有害物質(zhì)未完全滅活被排出實驗室，其對周邊環(huán)境有很大污染風(fēng)險，甚至?xí)�將致命病毒傳播出去，因此必須要對BSL-3實驗室脈動真空滅菌柜滅菌效果進(jìn)行驗證，把污染風(fēng)險降到最低程度。

BSL-3實驗室脈動真空滅菌柜滅菌效果監(jiān)測方法主要包括以下幾類：

一、物理參數(shù)監(jiān)測
在脈動真空滅菌柜的HMI界面上直接監(jiān)視腔體和夾套溫度、壓力、滅菌時間等參數(shù)，并使用打印機(jī)打印、記錄下來。另外，脈動真空滅菌柜在整個工作流程過程中，若有溫度或壓力未滿足參數(shù)設(shè)定值要求，則系統(tǒng)會發(fā)出報警，要求運維人員對相應(yīng)影響因素進(jìn)行改進(jìn)。

脈動真空滅菌柜每次運行均須對物理參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測，如滅菌階段溫度、壓力和滅菌時間等。若滅菌程序運行過程中有報警發(fā)生，必須消除故障后再次運行該程序，直到程序完全運行且無報警發(fā)生方可開門取出廢棄物。

二、化學(xué)監(jiān)測
化學(xué)監(jiān)測是利用化學(xué)指示劑（CI= Chemical Indicator）在一定溫度、作用時間與飽和真空適當(dāng)結(jié)合的條件下受熱變色的特點，用于間接指示滅菌效果或滅菌過程的監(jiān)測方法。化學(xué)監(jiān)測常用的方法有：
1）BD測試：用于檢查滅菌器腔體經(jīng)抽真空后殘留冷空氣的濃度，監(jiān)測真空水平、是否漏氣等，殘余冷空氣的存在是滅菌器滅菌失敗的主要原因。測試時將標(biāo)準(zhǔn)BD測試包放于滅菌器排氣口上方，滅菌器內(nèi)不能放入其它待滅菌物品。循環(huán)完成后，取出BD包驗證是否滿足要求。BSL-3實驗室每日開始滅菌運行前進(jìn)行，合格后方可使用。

2）指示膠帶：放在滅菌包外，BSL-3實驗室每個滅菌包包外均應(yīng)貼有包外化學(xué)指示膠帶或包外指示卡，用于指示每一包物品是否經(jīng)過了滅菌處理。

3）指示卡：可以指示滅菌溫度和持續(xù)作用時間，以間接指示滅菌效果。監(jiān)測時應(yīng)放于測試包或待滅菌包內(nèi)。每次滅菌都要使用，每包必用。滅菌后指示色塊達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)顏色為合格，若發(fā)現(xiàn)包內(nèi)指示卡不合格，應(yīng)找出原因，重新滅菌處理直到合格為止。

三、生物監(jiān)測：生物監(jiān)測是一種利用生物指示劑（BI= Biological Indicator）對脈動真空滅菌器滅菌效果進(jìn)行驗證的重要監(jiān)測方法。將純棉手術(shù)斤折疊成23cm x 23cm x 15cm大小的標(biāo)準(zhǔn)試驗包，將兩支嗜熱脂肪地芽孢桿菌（ATCC7953）放于包中心，將試驗包置于滅菌器腔體冷凝水排放口上方，門關(guān)閉并密封后從程序列表中選擇固體滅菌程序，滅菌周期完成后從包中取出，擠碎指示管內(nèi)安瓿讓培養(yǎng)液浸透管內(nèi)菌片，放于56℃專用恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，連同陽性對照管觀察結(jié)果。所有包內(nèi)滅菌后指示管內(nèi)培養(yǎng)液均沒有變色，同時陽性對照管內(nèi)培養(yǎng)液變成黃色，可判定滅菌合格。脈動真空滅菌器每周應(yīng)進(jìn)行一次生物監(jiān)測。

BSL-3實驗室過氧化氫空間滅菌器滅菌效果監(jiān)測方法：

不同于脈動真空滅菌器是對實驗操作過程所產(chǎn)生的固體或液體廢棄物進(jìn)行滅菌，氣化過氧化氫空間滅菌系統(tǒng)是對BSL-3實驗室物體表面及空間進(jìn)行消毒或滅菌，能有效降低生物安全實驗室的生物負(fù)載，也能保證生物安全實驗室的無菌操作環(huán)境。

不同的BSL-3實驗室，需要設(shè)計不同的過氧化氫空間滅菌方案。過氧化氫空間滅菌器滅菌效果的驗證時通過在難以滅菌的位置處放置BI生物指示劑、CI化學(xué)指示劑，如天花板、地板等難以到達(dá)的角落。CI化學(xué)指示劑變色均勻，BI生物指示劑不銹鋼片上分布有嗜熱脂肪地芽孢桿菌（ATCC12980），滅菌后在55-60℃專用恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)以檢測滅菌效果，BI是判斷滅菌成功與否的唯一標(biāo)準(zhǔn)。

使用生物監(jiān)測進(jìn)行滅菌效果的驗證時，BI生物指示劑，即嗜熱脂肪地芽孢桿菌的培養(yǎng)對恒溫培養(yǎng)箱具有較高的要求：

1. 其中非常重要的是溫度的均一性（TemperatureUniformity/In Space）：例如在做56℃嗜熱脂肪地芽孢桿菌培養(yǎng)時，要求溫度均一性為±1℃，即在任一時刻和擱板上任一位置處，溫度均在55~57℃范圍之內(nèi)，超出0.1℃即視為偏差和不合格。

2. 升降溫時間：微生物實驗室恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱的使用是非常頻繁的，有時候一段時間內(nèi)開關(guān)門的次數(shù)會較多，使腔體內(nèi)溫度較快的出現(xiàn)偏差。如何保證恒溫培養(yǎng)箱在關(guān)門之后進(jìn)行快速的溫度恢復(fù)，是衡量其性能的重要因素，故疾控系統(tǒng)、以及出入境檢疫檢驗部門和制藥領(lǐng)域的微生物實驗室更傾向于采用不銹鋼電阻加熱管和壓縮機(jī)制冷的恒溫培養(yǎng)箱。

3. 培養(yǎng)效果：有些恒溫培養(yǎng)箱經(jīng)過幾天運行之后，會出現(xiàn)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液干燥凝固的情況，造成菌體培養(yǎng)失敗或失效。恒溫培養(yǎng)箱采用頂部回風(fēng)和側(cè)面送風(fēng)的循環(huán)方式是避免這種情況的一種比較合理的設(shè)計。
恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱不僅可以培養(yǎng)BI生物指示劑，用于脈動真空滅菌器和過氧化氫空間滅菌器滅菌效果的監(jiān)測，保證生物安全實驗室的安全，還可以用于一次性使用衛(wèi)生用品如手套、口罩和防護(hù)服等的微生物檢測和衛(wèi)生保證。

如GB19082-2009和GB15979-2002中規(guī)定了產(chǎn)品微生物檢測方法，其中大腸桿菌檢測方法：取樣液5mL，接種50mL乳糖膽鹽發(fā)酵管，置35℃±2℃培養(yǎng)24h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報告為大腸桿菌群陰性。如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則劃線接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置35℃±2℃培養(yǎng)18-24h，觀察平板上菌落形態(tài)。典型的大腸桿菌落為黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紅色，中心較深的菌落。取疑似菌落1-2個作革蘭氏染色鏡檢，同時接種乳糖發(fā)酵管，置35℃±2℃培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)氣情況。

除了以上生物安全實驗室的應(yīng)用，恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱在制藥領(lǐng)域無菌控制方面也發(fā)揮著必不可少的作用，如《中國藥典》2015版四部和2020版四部生物檢定通則增修訂（公示中）中都明確了其應(yīng)用和微生物培養(yǎng)的方法。

2020版四部生物檢定通則增加了滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則，用于脈動真空滅菌器和過氧化氫空間滅菌器滅菌效果的生物監(jiān)測。2015版四部中如1101無菌檢查法，用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、輔料、原料及其他品種是否無菌的一種方法，防止微生物污染。恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱主要應(yīng)用包含：培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶是否合格的檢測；空氣、純化水、設(shè)備表面等以及原料、樣品、半成品的檢測，防止微生物污染，保證無菌操作和生產(chǎn)，此時培養(yǎng)的真菌或細(xì)菌所需的溫度為20~25℃，30~35℃，35~37℃和42~43℃等，要求的溫度均一性仍為±1℃。

一般疾控系統(tǒng)微生物實驗室和出入境檢疫檢驗部門使用幾臺小的恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱（Reach-In）進(jìn)行BI生物指示劑或細(xì)菌、真菌的培養(yǎng)即可滿足要求。而對于一些制藥企業(yè)來說，無論從實驗室空間占用方面，還是培養(yǎng)箱內(nèi)部容積和價格成本方面來說，多臺小的恒溫培養(yǎng)箱/生化培養(yǎng)箱并不是最優(yōu)的解決方案，步入式培養(yǎng)箱（Walk-In）反而是更好的選擇。