定量Western Blot指南：內(nèi)參質(zhì)控

上期小編為大家介紹了以單一看家蛋白作為定量Western Blot內(nèi)參蛋白的分析方法，這次咱不得不說(shuō)說(shuō)以全蛋白為內(nèi)參的分析方法。
 

期刊JBC（The Journal of Biological Chemistry）在Western Blot數(shù)據(jù)要求中指出，對(duì)于半定量蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，最佳的內(nèi)參為全蛋白內(nèi)參，如果以看家蛋白為內(nèi)參，需要提供其在實(shí)驗(yàn)處理中表達(dá)量恒定的實(shí)驗(yàn)證明。
 

全蛋白作為內(nèi)參的優(yōu)勢(shì)在于:

1、目標(biāo)蛋白的相對(duì)豐度為目標(biāo)蛋白強(qiáng)度與全蛋白強(qiáng)度比，不再依賴于單一蛋白強(qiáng)度值。

2、敏感性好。

3、線性范圍寬。

4、蛋白可視化。

5、更適用于低豐度表達(dá)蛋白。
 

如果考慮使用全蛋白作為內(nèi)參，之前只有兩種方法，一是使用考染膠，平行跑兩塊膠，問(wèn)題在于很難保證重復(fù)性；二是使用麗春紅染料進(jìn)行印跡膜染色，問(wèn)題在于穩(wěn)定差，很難實(shí)現(xiàn)全蛋白定量，隨著熒光蛋白染色技術(shù)的問(wèn)世，全蛋白定量問(wèn)題得以順利解決。
 

AzureRed全蛋白染色進(jìn)行歸一化
 

“總蛋白歸一化”或TPN變得越來(lái)越流行，可以避免依賴看家蛋白進(jìn)行歸一化的許多缺點(diǎn)。在該方法中，將目標(biāo)蛋白的灰度值與加載在泳道中的總蛋白的灰度值進(jìn)行比較。TPN比使用單一蛋白作為歸一化更具有優(yōu)勢(shì)，例如不易受樣品之間蛋白變化的影響，不是觀察一種蛋白的強(qiáng)度，而是測(cè)量每條泳道的灰度值。由于TPN技術(shù)消除了許多與信號(hào)歸一化相關(guān)的問(wèn)題，因此發(fā)表文章越來(lái)越多地要求使用總蛋白信號(hào)進(jìn)行歸一化。
 

AzureRed熒光蛋白染色是一種用于凝膠和印跡膜的定量總蛋白染色試劑，與下游蛋白分析兼容，包括Western Blot。AzureRed是染色應(yīng)用的理想選擇，包括轉(zhuǎn)印后染色以確認(rèn)從凝膠到膜的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況，以及定量蛋白。

AzureRed總蛋白和三個(gè)靶標(biāo)蛋白同時(shí)成像

向凝膠中加入稀釋的HeLa細(xì)胞裂解物。轉(zhuǎn)印后，將印跡用AzureRed染色，然后在不脫色情況下加入Tubulin，

ß-actin和GAPDH探針。 用Sapphire 雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)掃描成像。四個(gè)通道進(jìn)行疊加，

總蛋白質(zhì)（AzureRed染色）以灰色顯示;Tubulin-紅色，ß-actin-藍(lán)色和GAPDH-綠色。

AzureRed熒光蛋白染色是熒光Western Blot定量的理想選擇。寬廣的線性動(dòng)態(tài)范圍確保AzureRed成為解決蛋白上樣變化的有效標(biāo)準(zhǔn)。AzureRed的一個(gè)關(guān)鍵特性是將其融入現(xiàn)有Western Blot工作流程的簡(jiǎn)單性。
 

AzureRed染料可與常用熒光探針同時(shí)檢測(cè)，無(wú)干擾，允許在一張印跡膜上檢測(cè)多種蛋白質(zhì)。使用AzureRed可以進(jìn)行多色印跡的總蛋白歸一化，不需要?jiǎng)冸x和重孵育，可以在一張印跡膜上定量多種蛋白。 該方法快速，可以與感興趣蛋白一同成像。有關(guān)AzureRed熒光蛋白染色的更多詳細(xì)信息，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)如下鏈接：www.azurebiosystems.com。

與常見的看家蛋白相比，AzureRed具有更寬的線性動(dòng)態(tài)范圍

單色通道圖像A）AureRed染色總蛋白B）Tubulin C）β-action和D）GAPDH。AzureRed信號(hào)的優(yōu)異動(dòng)態(tài)范圍與實(shí)際加載的蛋白量顯示在圖像（A）中。使用AzureSpot軟件定量來(lái)自總蛋白和看家蛋白的信號(hào)，并將得到的值相對(duì)于每個(gè)樣品加載的

蛋白量（E）作圖。與常見的看家蛋白相比，AzureRed表現(xiàn)出更強(qiáng)的相關(guān)性和更廣泛的動(dòng)態(tài)范圍。

Sapphire配合AzureRed總蛋白熒光染色劑可以做總蛋白歸一化和定量三個(gè)靶標(biāo)蛋白，生成可以信賴的定量Western Blot數(shù)據(jù)。
 

Azure300帶有Q模塊，可激發(fā)AzureRed等染料進(jìn)行全蛋白定量，最后化學(xué)發(fā)光條帶和總蛋白條帶同時(shí)在一張膜上成像，滿足Nature，JBC等期刊雜志的總蛋白定量要求，幫助用戶發(fā)表文章。
 

專業(yè)的AzureSpot分析軟件

可做AzureRed總蛋白的型號(hào)：

SapphireNIR-Q，SapphireRGB，SapphireRGBNIR；Azure300Q，Azure400，Azure500Q，Azure600