海洋被子植物Zostera marina的PSI中依賴于NDH高效的環(huán)式電子通路

​作者：Ying Tan, Quan Sheng Zhang（張全勝，通訊作者）, Wei Zhao, Zhe Liu, Ming Yu Ma, Ming Yu Zhong, Meng Xin Wang（煙臺(tái)大學(xué)海洋學(xué)院）
時(shí)間：2019年7月25日
期刊：Photosynthesis Research
英文標(biāo)題：The highly efficient NDH‑dependent photosystem I cyclic electron flow pathway in the marine angiosperm Zostera marina
關(guān)鍵字：環(huán)式電子傳遞、NADPH脫氫酶復(fù)合體、放氧復(fù)合體、跨膜質(zhì)子梯度、大葉藻

過量輻射引起的光合器官的光氧化損傷是影響陸生和海生植物的主要脅迫因子之一。光氧化損傷會(huì)破壞ATP和NADPH產(chǎn)生的化學(xué)計(jì)量平衡，植物必須對(duì)ATP和NADPH進(jìn)行非常精確的動(dòng)態(tài)控制，以維持高效的光合作用，滿足植物不同的代謝需求。通過調(diào)整線性電子(LEF)到光系統(tǒng)I循環(huán)電子 (PSI-CEF)的速率，ATP /NADPH比值可以被靈活地調(diào)整到所需的水平。當(dāng)由兩個(gè)光系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)的LEF從水到NADP+時(shí)，O2在氧進(jìn)化復(fù)合體(OEC)發(fā)生進(jìn)化，同時(shí)產(chǎn)生NADPH和ATP。作為一種補(bǔ)充機(jī)制，PSI-CEF催化電子從PSI受體轉(zhuǎn)移到質(zhì)體醌(PQ)，使光化學(xué)激發(fā)的電子通過cytb6f復(fù)合物和PC返回到PSI，而不需要凈生成任何基質(zhì)還原劑。在這個(gè)過程中，質(zhì)子被從基質(zhì)中取出并泵入到類囊體腔，產(chǎn)生了跨類囊體的質(zhì)子梯度(△pH)，并通過CF0F1-ATP合酶通道驅(qū)動(dòng)ATP合成。因此，PSI-CEF的活性被認(rèn)為有助于平衡由光反應(yīng)產(chǎn)生的ATP/NADPH的比例。

在被子植物中至少提出了兩種備選的PSI-CEF通路。主要途徑是涉及質(zhì)子梯度調(diào)節(jié)5 (PGR5)和類PGR5光合顯型1 (PGRL1)的抗霉素a敏感途徑。次要途徑是由對(duì)魚藤酮敏感的葉綠體NADPH脫氫樣(NDH)復(fù)合物介導(dǎo)的。擬南芥突變體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PGR5/L1和NDH依賴的循環(huán)電子傳遞對(duì)跨類囊體膜質(zhì)子梯度分別貢獻(xiàn)30%和5%。葉綠體NDH復(fù)合體是位于類囊體基質(zhì)中的一種多蛋白復(fù)合體，最初是通過與線粒體呼吸電子傳遞中的復(fù)合體I同源而發(fā)現(xiàn)的。迄今為止，在葉綠體NDH復(fù)合體中共檢測(cè)到29個(gè)亞基，其中包括五個(gè)亞復(fù)合體:膜亞復(fù)合體、亞復(fù)合體A、亞復(fù)合體B、腔內(nèi)亞復(fù)合體和電子供體結(jié)合亞復(fù)合體。葉綠體NDH復(fù)合體缺乏氧化NAD(P)H的亞基，但有與Fd位點(diǎn)鏈接的供體連接亞復(fù)合體，NAD(P)H將電子經(jīng)Fd傳遞給NDH復(fù)合體繼而還原PQ庫(kù)。

目前提出了依賴NDH的PSI-CEF的三個(gè)主要功能：(1)通過下調(diào)通過cytb6/f復(fù)合物的電子輸運(yùn)以酸化類囊體腔來(lái)啟動(dòng)光保護(hù)，并在PSII中誘導(dǎo)非光化學(xué)猝滅的qE組分來(lái)消散吸收的多余光能；(2)在各種嚴(yán)重脅迫條件下，通過保持ATP/NADPH的高輸出比來(lái)保護(hù)光合器官免受基質(zhì)過度還原的傷害；(3)產(chǎn)生額外的ATP來(lái)驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)修復(fù)，滿足植物的各種代謝需求。然而，葉綠體NDH復(fù)合體的生理功能可能因物種、處理?xiàng)l件、生長(zhǎng)環(huán)境等有所不同。已有研究表明，NDH依賴的PSI-CEF損傷不影響整體光合作用，說(shuō)明NDH依賴的PSI-CEF在穩(wěn)態(tài)光合作用中不是必需的，雖然它在波動(dòng)環(huán)境下的光合調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。一般認(rèn)為NDH依賴的PSI-CEF不參與弱光條件下的光合作用，但最近的一項(xiàng)研究表明，水稻的NDH復(fù)合體缺失可以在弱光條件下降低碳同化速率和植物生物量積累。絕大多數(shù)的海洋植物(Peltier和Cournac 2002)，以及一些陸生高等植物，如所有種類的球根植物和松科植物，以及部分種類的蘭科和天竺葵科植物，均未檢測(cè)到NDH基因編碼。缺乏NDH復(fù)合體，表明該復(fù)合體的功能可有可無(wú)，可能存在一些替代或補(bǔ)償?shù)碾娮觽鬟f途徑彌補(bǔ)其功能。相反，NDH復(fù)合體在某些物種中的存在可能提供一個(gè)關(guān)鍵的選擇優(yōu)勢(shì)，使光合反應(yīng)能夠適應(yīng)環(huán)境壓力。大多數(shù)海洋植物的NDH復(fù)合體的缺失可能與它們相對(duì)穩(wěn)定的海洋棲息地有關(guān)。

大葉藻屬(Zostera marina, Zosteraceae)，又稱eelgrass，是一種廣泛分布的海草物種，由陸地單角類的淡水祖先進(jìn)化而來(lái)，并成功地過渡到完全淹沒的海洋分類單元。在進(jìn)化過程中，基因組的缺失和擴(kuò)增現(xiàn)象頻繁發(fā)生，為其海洋生活方式所需的結(jié)構(gòu)和生理適應(yīng)提供了遺傳變異。根據(jù)氨基酸序列的多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大葉藻具有完整的29個(gè)編碼葉綠體NDH亞基的基因，即使在海洋被子植物中也很少見。分類與大葉藻同目的波喜蕩草屬（Posidonia）和根枝草屬（Amphibolis）未檢測(cè)到編碼葉綠體NDH復(fù)合體的基因。因此，葉綠體NDH復(fù)合體在Z. marina的作用需要探索。在本文中，我們提出了在Z. marina中高效的NDH依賴的PSI-CEF，這可能與OEC失活以及光合性能的維持有關(guān)。此外，我們提供的證據(jù)表明，在過量輻照下依賴NDH和依賴PGR5/Li的PSI-CEF之間存在此消彼長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化。

—— 材料和方法 ——

植物材料

在位于中國(guó)山東半島北側(cè)的榮成(37°16′N, 122°41′E)3 m深度的次潮汐海草床上采集到根莖系統(tǒng)完整(6-9節(jié)間)的健康大葉藻。在2019年5月連續(xù)幾天的下午晚些時(shí)候進(jìn)行采樣。大葉藻在實(shí)驗(yàn)前在過濾海水水族館預(yù)培養(yǎng)3天，在15℃和100μmolm-2s-1，以10:14-h的光：暗周期進(jìn)行照明。根據(jù)最小飽和光強(qiáng)度，照明由A型LED燈提供，色溫范圍6000 K。從葉鞘上方2厘米處采集葉片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)量，以保持相同的年齡。

進(jìn)化分析

基于29個(gè)NDH亞單位的串聯(lián)序列，采用MEGA 5.0程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行了1000次重復(fù)的bootstrap測(cè)試。這30個(gè)物種的所有這些序列都是通過BLASTP分析從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)檢索到的。交互式生命樹(https:// url .embl.de/)用于對(duì)樹進(jìn)行注釋和修飾。

光處理和抑制劑處理

暗適應(yīng)過夜的大葉藻暴露在三種不同的光強(qiáng)度，50,300和600μmolm-2s - 1反應(yīng)3小時(shí)。這些處理在下文稱為弱光（LL）、中光（ML）和強(qiáng)光（HL），它們通過德國(guó)DUAL-PAM-100來(lái)測(cè)量最小飽和光強(qiáng)來(lái)確定。所有處理均在光照培養(yǎng)箱(GZP-250N，上海森欣實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)中進(jìn)行，控制海水溫度為15℃，模擬其在自然環(huán)境中的生長(zhǎng)狀態(tài)。光由A型LED燈提供，色溫范圍6000 K。在測(cè)定熒光動(dòng)力學(xué)之前，隨機(jī)選取暴露于光照下的葉片，每隔20分鐘至暗適應(yīng)15分鐘。Antimycin A (AA, Sigma)和rotenone (Aldrich)分別用于抑制PGR5/L1和NDH依賴的PSI-CEF。分別以甲醇和二甲亞砜為溶劑，制備了AA和魚藤酮原液。處理后樣品的溶劑濃度低于1% (v/v)。葉片使用過濾海水或含1μM AA, 150μM魚藤酮的海水進(jìn)行飽和，并在光處理之前，在15℃的黑暗條件下孵育葉片1 h。

葉綠素A熒光和P700測(cè)定

利用DUAL-PAM-100測(cè)量系統(tǒng)同時(shí)測(cè)量葉綠素a熒光和P700+吸光度變化。在微弱的調(diào)制光下（5μmol m-2s-1）測(cè)量出最小熒光值（Fo）后，分別對(duì)暗適應(yīng)和光適應(yīng)條件下的葉片在300ms的飽和脈沖光下（16000μmol m-2 s-1）測(cè)量Fm和Fm’。Fs是光照條件下的穩(wěn)態(tài)熒光值。P700+的信號(hào)會(huì)在最小（完全還原）和最大（完全氧化）之間變化。最大的變化在P700完全氧化狀態(tài)(Pm)和一個(gè)給定的光狀態(tài)(Pm’)是在遠(yuǎn)紅光(250μmol m− 2 s−1)和光化光（127μmol m− 2 s−1）預(yù)照射后由飽和脈沖光測(cè)量。PSII的最大光量子產(chǎn)量：Fv/Fm = (Fm − Fo)/Fm，PSII的電子傳遞速率：ETRII = 0.84 × PPDF × 0.5 ×( ­Fm’—Fs)∕Fm’，PSI的電子傳遞速率：0.84 × PPDF × 0.5 ×( ­Pm’—P)/Pm，PSI-CEF：ETRI-ETRII。

暗適應(yīng)樣品在光化光下照射2min，在關(guān)閉AL后，我們監(jiān)測(cè)了隨后葉綠素?zé)晒獾乃矔r(shí)增加作為NDH活性的一個(gè)指標(biāo)，關(guān)閉AL后10 s內(nèi)測(cè)定鼓包的初始斜率。根據(jù)Li等人的方法，在暗適應(yīng)葉片中，當(dāng)光誘導(dǎo)吸光度在830nm處發(fā)生變化時(shí)，監(jiān)測(cè)P700+的還原動(dòng)力學(xué)。我們測(cè)量P700的再次還原之前采用一個(gè)專用校準(zhǔn)程序?qū)�P700信號(hào)進(jìn)行歸一化處理。遠(yuǎn)紅光照射后10 s內(nèi)測(cè)定P700+再還原半衰期縮短(t1/2)，表明PSI-CEF活性升高。

快速OJIP熒光瞬態(tài)測(cè)量

利用多功能植物效率分析法測(cè)定葉綠素?zé)晒饪焖僬T導(dǎo)曲線。由曲線得到如下數(shù)據(jù)：20 μs的最小熒光值（Fo），最大熒光值（Fm），0.3ms的熒光值（K-step，F(xiàn)k），3ms的熒光值（J-step，F(xiàn)j），30ms的熒光值（I-step，F(xiàn)i）。為了評(píng)價(jià)PSII的活性，計(jì)算了PSII從光子吸收到系統(tǒng)間電子受體減少的能量守恒性能指數(shù)(勢(shì))：PIABS=4 ×(Fk − Fo) × Fm × (Fm − FJ)/Fv × (FJ − Fo)2，作為PSII供體側(cè)指標(biāo)監(jiān)測(cè)的k步歸一化可變熒光被計(jì)算為WK = (Fk−Fo)/(FJ−Fo)。

ECS分析

電致變色效應(yīng)吸光度信號(hào)變化的測(cè)量是用DUAL-PAM-100的P515/535模塊在515nm波長(zhǎng)下進(jìn)行監(jiān)測(cè)。樣品先暗適應(yīng)15min，再在127μmolm-2s-1的光化光下照射5min，然后再進(jìn)行測(cè)量。AL被關(guān)閉，記錄ECS的衰變動(dòng)力學(xué)，以確定總ECS，代表了總質(zhì)子動(dòng)能(pmf)的大小及其組成部分，即ΔpH和Δψ。ECS衰減(gH+)是通過最初的300ms響應(yīng)速率到P515發(fā)射結(jié)束來(lái)估計(jì)的。

免疫印跡分析

從處理的葉片中分離出葉綠體按照是廠家的指導(dǎo)使用Plants Leaf Chloroplast Rude Divide Kit測(cè)量。葉綠素含量測(cè)定采用Porra等人的方法。根據(jù)Towbin等人的描述，對(duì)NdhH、NdhS、PGR5、PGRL1、PsbO、PsbP和PsbQ(Agrisera，瑞典)的抗體進(jìn)行Westernblot分析。采用Rubisco大亞單位抗體(RbcL, Agrisera，瑞典)作為內(nèi)參對(duì)照。用凝膠對(duì)x射線膠片上產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光帶進(jìn)行密度測(cè)量使用圖像實(shí)驗(yàn)室軟件對(duì)Doc XR+系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)進(jìn)行量化。每個(gè)目標(biāo)條帶的總密度都是基于RbcL密度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的。

數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有參數(shù)均采用單因素方差分析。采用Tukey趨勢(shì)檢驗(yàn)進(jìn)行事后比較。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P < 0.05。使用Origin9.0程序，采用單指數(shù)函數(shù)擬合法對(duì)P700+再還原的每個(gè)點(diǎn)進(jìn)行擬合。使用線性回歸分析來(lái)評(píng)估WK，PIABS，和鼓包。

—— 結(jié)果 ——

NDH復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)生分析

基于連接的29個(gè)NDH亞基序列構(gòu)建了葉綠體NDH復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)生樹，顯示了NDH復(fù)合序列在藍(lán)藻、苔蘚、蕨類、蕨類和石生植物中NDH復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在藍(lán)藻門，輪藻門和蕨類植物NDH復(fù)合物均不完整，并且部分被子植物中也缺失部分NDH亞基的。Z.marina包含五個(gè)完整的NDH亞復(fù)合物。海洋植物中除了原始藻類之外，綠藻、硅藻、紅藻和褐藻等常見藻類都缺少編碼葉綠體NDH復(fù)合體亞基的同源基因，這表明Z. marina中NDH復(fù)合體的存在可能在光合作用中發(fā)揮重要作用。
 

圖1 葉綠體NDH復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)生樹

PSI循環(huán)電子流的動(dòng)態(tài)變化

以ETRI-ERTII為代表的PSI-CEF的活性在三個(gè)水平的照射下逐漸增加。同樣，P700+再誘導(dǎo)所示的PSI-CEF活性也隨著光強(qiáng)的升高而逐漸升高。這些結(jié)果表明，大葉藻PSI-CEF隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，同時(shí)也會(huì)隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)而增強(qiáng)。
 

圖2 在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）處理?xiàng)l件下ETRI-ETRII隨時(shí)間的變化過程。平均值±SD由四個(gè)獨(dú)立樣本計(jì)算。采用Tukey趨勢(shì)檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)
 

圖3 a在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）處理?xiàng)l件下P700+再還原半衰期隨時(shí)間的變化過程。平均值±SD由四個(gè)獨(dú)立樣本計(jì)算。每個(gè)點(diǎn)表示對(duì)指數(shù)函數(shù)的擬合（所有R2值＞0.96）

兩個(gè)PSI循環(huán)電子途徑的動(dòng)態(tài)變化

利用光照后葉綠素?zé)晒獾乃矔r(shí)增強(qiáng)來(lái)測(cè)定NDH依賴的PSI-CEF。如圖4a所示，葉綠素?zé)晒庠诠庹蘸蟪霈F(xiàn)了明顯的瞬時(shí)增強(qiáng)，且這種增強(qiáng)在HL條件下大于ML大于LL光照處理。此外，光照后的初始斜率隨著曝光時(shí)間的增加而逐漸增大(圖4c)，說(shuō)明NDH依賴的PSI-CEF被顯著激活。為了確定處理過量照射的兩個(gè)PSI-CEF通路的持續(xù)響應(yīng)，我們使用從Z. marina葉子中分離的葉綠體，使用特異性抗體進(jìn)行免疫印跡分析。針對(duì)NdhH亞基的抗體只能識(shí)別45kDa的一個(gè)多肽，而抗NdhS的抗體只能識(shí)別27-kda的一個(gè)蛋白。每個(gè)樣本中，anti-PGR5識(shí)別一個(gè)15-kda蛋白，anti-PGRL1識(shí)別一個(gè)29-kda蛋白（圖5）。光密度分析顯示，NdhH和NdhS蛋白水平所描述的ndh依賴通路活性明顯隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。相比之下，由PGR5和PGRL1蛋白水平表達(dá)的PGR5/L1相關(guān)的通路活性在光照開始后的早期最高，隨后下降到穩(wěn)定水平(圖5b)，表明PGR5 /l1依賴和nndh依賴的PSI-CEF通路可能在不同的光照期交替作用。

圖4 a一種監(jiān)測(cè)NDH活性的經(jīng)典葉綠素?zé)晒庾粉�，b在LL（50μmolm-2 s– 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）條件下照射3h后鼓包的響應(yīng)。b在LL（50μmolm-2 s– 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）條件下鼓包的初始斜率隨時(shí)間的變化過程。平均值±SD由四個(gè)獨(dú)立樣本計(jì)算。采用T檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)
 

圖5 采用特異性抗體Western blot法分析四種具有代表性的PSI-CEF蛋白含量RbcL,NdhH, NdhS, PGR5, 和PGRL1蛋白表達(dá)水平在HL下隨時(shí)間的變化過程。一個(gè)稀釋系列（0h 深色；3.75、7.5和15μg葉綠素對(duì)應(yīng)于25、50和100%的0 h黑暗的樣本）的Z. marina的葉綠體蛋白放在了1-3道。多肽的分子質(zhì)量顯示在邊緣上。b通過視頻密度分析NdhH(灰色網(wǎng)格條)、NdhS(淺灰色條)、PGR5(深灰色條)和PGRLI(黑色條)的化學(xué)發(fā)光條帶。平均值±SD由三個(gè)獨(dú)立樣本計(jì)算。不同字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05，單因素方差分析)。

循環(huán)電子流對(duì)ΔpH的貢獻(xiàn)

通過P515來(lái)測(cè)量電致變色效應(yīng)，用于評(píng)估ΔpH（圖6），初始過渡在20分鐘后趨于平穩(wěn)(圖6 b)。在AA 和魚藤酮處理下△pH的降低幅度相似，這表明這兩個(gè)通路對(duì)PSI-CEF有相似的貢獻(xiàn)。值得注意的是在△pH除了前期略有升高之外，魚藤酮處理能抑制△pH的增加（圖6）。P515關(guān)光響應(yīng)的初始速率gH+可以被看作是照明過程中H+流出速率的度量，它是ATP-ase的質(zhì)子電導(dǎo)率的函數(shù)。在這里,gH+隨暴露時(shí)間逐漸減少，這與∆pH呈現(xiàn)一個(gè)此消彼長(zhǎng)的關(guān)系。PSI-CEF抑制劑處理后，gH+在初始階段沒有明顯變化，而gH+在20 - 30min內(nèi)顯著下調(diào)，說(shuō)明PSI-CEF對(duì)ATP合成的貢獻(xiàn)主要是在后期光照期間（圖6b）。

圖6 a 記錄經(jīng)過水（黑色三角形）、AA（灰色圓形）和魚藤酮（白色三角形）處理后暗-光和光-暗誘導(dǎo)P515緩慢變化對(duì)30min HL的響應(yīng)。每條曲線基于4次重復(fù)的平均值。經(jīng)過水（黑色圓形，淡灰色柱狀圖）、AA（黑色方形，灰色柱狀圖）和魚藤酮（黑色三角形，深灰色柱狀圖）處理后，△pH（線狀）gH+（柱狀）對(duì)HL隨時(shí)間的變化。平均值±標(biāo)準(zhǔn)差由四個(gè)獨(dú)立樣本計(jì)算。不同的字母有顯著差異(P < 0.05，單因素方差分析)。

NDH依賴性PSI- CEF與PSII活性的關(guān)系

為了確定過量光照射下的OEC蛋白水平，使用特異性抗體從對(duì)OEC的三個(gè)外周蛋白進(jìn)行免疫印跡分析�？筆sbO亞基(anti-PsbO)的抗體只能識(shí)別33 kDa的一個(gè)多肽，而抗psbp和抗PsbQ的抗體則分別識(shí)別23 kDa和24 kDa的蛋白(圖7a)。光密度分析顯示，HL暴露后PsbO和PsbP蛋白水平明顯下降，而PsbQ未見明顯變化(圖7b)。

圖7 a采用免疫印跡法在高光(600μmol m−2 s-1)和對(duì)照照射180分鐘條件下分析了三種具有代表性的OEC的蛋白含量。為了檢測(cè)各自的信號(hào)，使用一個(gè)稀釋系列(0 h黑暗；3.75、7.5和15μg的葉綠素含量對(duì)應(yīng)于25，50和100%的0 h黑暗樣本)的Z. marina葉綠體蛋白放置于1-3行。多肽的分子質(zhì)量顯示在邊緣上。b在對(duì)照（暗灰柱）和HL處理下照射180min采用視頻密度分析化學(xué)發(fā)光條帶。平均值±SD由三個(gè)獨(dú)立樣本計(jì)算。不同字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05，單因素方差分析)

隨著光強(qiáng)的增加，OKJIP葉綠素?zé)晒馑矐B(tài)強(qiáng)度發(fā)生變化，說(shuō)明過量輻照對(duì)PSII的性能有顯著影響(圖8a)。隨著ML和HL暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，PSII的最大量子產(chǎn)率(Fv/Fm)和PSII性能指數(shù)(PIABS)逐漸降低(圖8b, c)。此外，隨著光強(qiáng)和照射時(shí)間的增加，K點(diǎn)相對(duì)熒光(WK)的熒光相對(duì)變大(圖8d)，這表明PSII供體側(cè)OEC在過量照射下持續(xù)失活。在HL和ML光照處理下，PIABS和WK之間的回歸分析顯示了顯著的負(fù)相關(guān)(圖9a)，這表明PSII活性與OEC密切相關(guān)。此外，在HL和ML處理下，光誘導(dǎo)的鼓包和WK之間存在顯著的線性正相關(guān)(圖9b)，這表明NDH依賴的PSI-CEF的激活與光誘導(dǎo)的OEC失活有關(guān)。

圖8 a 由OJIP的ΔVt曲線對(duì)LL（50μmol m−2 s-1 灰色圓形）、ML（300 μmol m−2 s-1 黑灰方形）、HL（600 μmol m−2 s-1黑色三角形）的響應(yīng)總結(jié)的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)的變化。字母K表示JIP測(cè)試用于計(jì)算結(jié)構(gòu)和功能參數(shù)所選擇的時(shí)間點(diǎn)。每條曲線基于4次重復(fù)的平均值。b、c、d圖分別是Fv/Fm、PIABS、WK在LL（黑色圓形）、ML（黑灰方形）、HL（黑色三角形）條件下隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化過程。平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)自4個(gè)獨(dú)立樣本。采用Tukey趨勢(shì)檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)(在ML組與HL組中所有數(shù)據(jù)的比較P < 0.05)。
 

圖9 a PIABS之間的線性關(guān)系，b 經(jīng)過ML（300μmol m−2 s-1）和HL（600 μmol m−2 s-1）處理后鼓包動(dòng)力學(xué)曲線和Wk的標(biāo)準(zhǔn)斜率。4個(gè)獨(dú)立樣本均數(shù)±SD(P < 0.05)。

—— 討論 ——

隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)和光照強(qiáng)度的升高，表征PSI-CEF活性的P700+再還原t1/2和ETRI-ETRII出現(xiàn)了相似的增加趨勢(shì)，說(shuō)明了Z.marinaPSI-CEF具有強(qiáng)大的能力。通過研究?jī)煞NPSI-CEF通路在過量照射下的動(dòng)力學(xué)，我們發(fā)現(xiàn)以P700+再還原t1/2為特征的PSI-CEF活性迅速增加，而以postillumination為特征的NDH依賴的PSI-CEF活性則呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢(shì)。這暗示了，優(yōu)先激活的依賴PGR5/L1的通路可能無(wú)法滿足光保護(hù)的需要，進(jìn)而需要NDH依賴通路的逐漸激活。正如Strand等人(2016)提出的，在ATP缺失導(dǎo)致了NADPH在基質(zhì)中的積累情況下，PGR5/L1依賴通路被迅速激活，從而恢復(fù)了ATP/NADPH的平衡。隨后，長(zhǎng)期的ATP合成不足導(dǎo)致PSI受體側(cè)關(guān)閉時(shí)，NDH依賴的PSI-CEF被激活。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，我們進(jìn)行了Western blot檢測(cè)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。在初始照明時(shí)，PGR5和PGRL1的表達(dá)上調(diào)，而在后期照明時(shí)，NdhS和NdhH的表達(dá)上調(diào)，這證實(shí)了在過量照射下，這兩種途徑之間存在交替作用。因此，PSI-CEF的作用并不局限于依賴于PGR5/ l1的通路，而依賴于NDH的通路可能在持續(xù)的過度照射中發(fā)揮更重要的作用。

為了進(jìn)一步說(shuō)明這兩種途徑的交替作用，我們選擇了兩種抑制劑分別抑制依賴于PGR5/L1和NDH的PSI-CEF�？偟膩�(lái)說(shuō)，ΔpH和gH+在AA和魚藤酮處理下均會(huì)降低，這表明PGR5/L1和NDH依賴的兩種方式的貢獻(xiàn)是相似的。在Z. marina中，NDH依賴途徑并不像大多數(shù)物種普遍認(rèn)為的那樣，是一種次要的PSI-CEF途徑。值得注意的是，在抑制依賴NDH的環(huán)式電子傳遞途徑的情況下，ΔpH在照明的初期階段略增強(qiáng)，但隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)略有下降。這可能反映了pgr5依賴通路在光照初期的激活，以補(bǔ)償減少的電子流。盡管如此,這種補(bǔ)償無(wú)法產(chǎn)生足夠的電子建立ΔpH。因此，在Z.marina中上調(diào)NDH依賴通路是導(dǎo)致大葉藻在高光暴露后期∆pH升高的主要原因。同時(shí)，在光照初期，AA在上ΔpH的顯著抑制效果和在光照后期魚藤酮對(duì)gH +的顯著抑制效果進(jìn)一步表明兩個(gè)通道之間的交替運(yùn)行。此外,在我們還發(fā)現(xiàn)，在Z.marina中ΔpH達(dá)到最大值的時(shí)間是20分鐘，而gH +隨HL時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，這暗示了ΔpH的構(gòu)建能力弱和ATP合成不足。

在光照過程中，除了PSII光化學(xué)活性Fv/Fm和PIABS降低了外，以WK為特征的PSII供體側(cè)(OEC)活性也對(duì)過量照射敏感。這與觀察到的PsbO和PsbP蛋白豐度的下調(diào)是一致的。眾所周知，PsbO在穩(wěn)定催化Mn簇方面發(fā)揮重要作用，而PsbP和PsbQ可以誘導(dǎo)OEC周圍的構(gòu)像變化，以確保PSII中Ca2+和Cl的結(jié)合。PsbO和PsbP的下調(diào)可能導(dǎo)致Ca2+的釋放，破壞Mn簇的結(jié)構(gòu)。已有研究表明，類囊體腔的酸化可以驅(qū)動(dòng)Ca2+/ H+ 反向運(yùn)轉(zhuǎn)，維持腔內(nèi)高濃度的Ca2+，從而維持OEC的穩(wěn)定性。我們的相關(guān)性分析顯示NDH依賴的PSI-CEF光化學(xué)活性與OEC失活之間呈線性正相關(guān)，暗示了兩者之間存在著實(shí)質(zhì)性的聯(lián)系。大葉藻被認(rèn)為至少經(jīng)歷了三次獨(dú)立的的進(jìn)化事件生活在海洋環(huán)境中。進(jìn)化過程中發(fā)生了多個(gè)基因組缺失和復(fù)制事件，其中紫外光、紅光和遠(yuǎn)紅光光敏感蛋白受體丟失。OEC在可見光下的失活可能與這種缺失有關(guān)，因?yàn)楣飧械鞍资荏w具有重要的保護(hù)和信號(hào)傳遞功能。因此，光失活的OEC是大葉藻響應(yīng)過度照射的核心問題，這與通常認(rèn)為的光抑制有所不同。

在過量輻照下，Z. marina中OEC的持續(xù)失活會(huì)導(dǎo)致PSII和PSI電子不足。NADPH作為重要的PSI電子供體， 通過膜結(jié)合的鐵氧還蛋白NADP(+)氧化還原酶(FNR)傳遞給Fd，然后通過NDH依賴的PSI-CEF來(lái)還原PQ。在光脅迫初期，PGR5/L1依賴的PSI-CEF被優(yōu)先激活，電子經(jīng)由Fd傳遞至PQ庫(kù)，而不是在基質(zhì)中積累還原力。隨著光照時(shí)間延長(zhǎng)大葉藻OEC持續(xù)失活導(dǎo)致了水光解功能受阻，光照后期電子不足。經(jīng)由PSI的有限電子可能優(yōu)先通過FNR直接轉(zhuǎn)移到NADP+上，產(chǎn)生NADPH。NDH依賴的 PSI-CEF是相應(yīng)的激活，從而在過度照射條件下維持一個(gè)高ATP / NADPH比，,并且在ΔpH 、ATP和還原能力之間維持一個(gè)很好的平衡。據(jù)報(bào)道，氧化戊糖-磷酸途徑可以以NADPH的形式增強(qiáng)還原力，在脅迫條件下支持NDH依賴的PSI-CEF的運(yùn)行。此外，先前的一項(xiàng)研究表明，抗壞血酸(AsA)能夠作為PSII的替代電子供體，可以在OEC失活情況下提供電子，支持A . thaliana中電子傳遞的運(yùn)行。

我們還比較了30個(gè)已完成基因組測(cè)序的物種29個(gè)葉綠體NDH復(fù)合體亞基的串聯(lián)序列，研究了Z. marina中NDH復(fù)合體蛋白編碼基因的系統(tǒng)發(fā)育。該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與最近NDH復(fù)合體演化研究的結(jié)論基本一致。分析發(fā)現(xiàn)葉綠體NDH復(fù)合體從海洋植物到陸生植物逐步完整。在海洋植物向陸地生境擴(kuò)散的過程中，NDH復(fù)合體似乎參與了光合器官應(yīng)對(duì)光強(qiáng)波動(dòng)、紫外線輻射和干旱等限制的適應(yīng)過程。海洋被子植物大葉藻具有完整的NDH復(fù)合體，在環(huán)境穩(wěn)定的海生植物中較為少見。這種差異可能是由于其獨(dú)特的進(jìn)化史與陸地起源有關(guān)。

綜上所述，Z. marina的特異性進(jìn)化歷史與其完整的葉綠體NDH復(fù)合體有關(guān)，NDH復(fù)合體能夠在過量照射條件下維持高效的NDH依賴的PSI-CEF。此外，由于OEC光損傷，水光解功能受阻，總體上電子不足，電子通過PSI可能優(yōu)先合成NADPH，既可滿足還原力的供應(yīng)和又支持了NDH依賴的PSI-CEF生成ΔpH和ATP的功能，從而維持了OEC的穩(wěn)定性。

原文信息
Tan Y, Zhang Q S, Zhao W, et al. The highly efficient NDH-dependent photosystem I cyclic electron flow pathway in the marine angiosperm Zostera marina. Photosynthesis Research, 2020: 1-14.