病毒疫苗收獲液澄清與核酸去除工藝開(kāi)發(fā)

默克與您攜手抗疫
 
在病毒疫苗的澄清工藝中，除了濾器的載量會(huì)作為重要的考察因素外，病毒回收率也十分重要。根據(jù)病毒的帶電性和粒徑特點(diǎn)，在病毒收獲液的澄清中往往會(huì)選擇低吸附的深層濾器，如默克Millistak+® CE系列深層濾器；或玻璃纖維/混合纖維素酯材料的表面濾器，如PolysepTM II。這樣的濾器選擇在保證澄清效果的同時(shí)也維持了很高的回收率。
 
下面讓我們來(lái)看看COVID-19同源病毒或工藝相近的病毒澄清和核酸去除工藝的應(yīng)用。
 
 
懸浮細(xì)胞Coronavirus疫苗病毒澄清工藝
 
Coronavirus為包膜病毒，粒徑75-160nm。
 
選擇深層過(guò)濾器Millistak+® CE50做為一級(jí)濾器，表面過(guò)濾器PolysepTM II 2.0/1.2um作為二級(jí)濾器進(jìn)行澄清時(shí)，料液濁度可以從100NTU以?xún)?nèi)的初始值降低至20NTU以下。同時(shí)濾器的載量可以達(dá)到400L/m2以上，回收率>90%。
   
Millistak+® CE系列深層濾器的填充材料為纖維素，從23cm2到1.1m2規(guī)格，覆蓋小試到大規(guī)模生產(chǎn)，簡(jiǎn)化您的澄清工藝。作為一款高顆粒物容納，低殘留體積的深層濾器，CE50的孔徑約0.6-1um，適用于細(xì)胞密度、濁度較低的收獲液澄清，對(duì)于病毒類(lèi)產(chǎn)品，可以保證很高的回收率。而PolysepTM  II表面濾器的材質(zhì)為玻璃纖維/混合纖維素酯，兼具深層濾器的高顆粒物容納特性和膜濾器的截留能力，同樣具有低吸附的特點(diǎn)，常用的規(guī)格有2.0/1.2um、1.0/0.5um、1.0/0.2um等，可作為低濁度料液的澄清濾器，或者在培養(yǎng)基、中間產(chǎn)品等料液的除菌過(guò)濾步驟前用作保護(hù)性濾器。良好的可放大性，支持小試工藝開(kāi)發(fā)到大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。  
 
Vero細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)條件下的病毒澄清工藝
 
在Vero細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的包膜病毒疫苗澄清工藝中，考慮到簡(jiǎn)化工藝步驟和優(yōu)越的濁度控制，我們使用了具有較強(qiáng)吸附能力的深層濾器Millistak+® HC Pro C0SP，當(dāng)高載量使用時(shí)（500L/m2以上），總回收率則達(dá)到90%，濁度20NTU以?xún)?nèi)�？梢�(jiàn)雖然C0SP吸附能力很強(qiáng)，但由于其同時(shí)具有高載量的特點(diǎn)，從而保證了較高的回收率。 Millistak+® HC Pro系列深層濾器，用合成材質(zhì)聚丙烯酸纖維和二氧化硅代替了傳統(tǒng)的硅藻土和纖維素，在單抗和疫苗澄清中，載量通常是傳統(tǒng)深層濾器的兩倍以上。同時(shí)由于人工合成材質(zhì)相比傳統(tǒng)材質(zhì)更為清潔，在工藝放大后，可以節(jié)省大量的沖洗用水，節(jié)約成本和時(shí)間。通常C0SP用于高密度細(xì)胞收獲液的單級(jí)澄清。
   
 
 
腺病毒病毒澄清工藝
 
腺病毒病毒廣泛應(yīng)用于疫苗和基因治療領(lǐng)域，在腺病毒的澄清工藝中，默克不同系列的深層濾器在高細(xì)胞密度和裂解細(xì)胞的情況下都能到達(dá)良好的澄清效果，并保持很高的回收率。下圖是Millistak+® HC和Millistak+® HC Pro系列濾器在腺病毒澄清中的常規(guī)表現(xiàn)。 在病毒疫苗工藝中，核酸殘留是客戶(hù)非常關(guān)心的質(zhì)控指標(biāo)。Benzonase®核酸內(nèi)切酶不但可以對(duì)料液中的核酸進(jìn)行高效切割，并且內(nèi)切酶和切割后核酸碎片可以在下游工藝中的超濾步驟輕松除去，無(wú)殘留風(fēng)險(xiǎn)。
 
Benzonase®核酸內(nèi)切酶在病毒載體疫苗中的應(yīng)用
 
對(duì)于Vero、CHO等細(xì)胞表達(dá)的疫苗類(lèi)生物制品，殘余DNA含量通常被限定為<100或10pg/劑。Benzonase®核酸內(nèi)切酶可以在37°C條件下，迅速將料液中的核酸切割成3-8bp的片段，從而大幅降低工藝過(guò)程中的核酸殘留，使得DNA殘余量達(dá)到要求。這些切割后的片段和Bensonase®內(nèi)切酶可以在下游的300kD超濾中輕松去除。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在經(jīng)過(guò)8個(gè)CV的透析換液之后，殘留的核酸片段和內(nèi)切酶可以達(dá)到99.9%的去除率。
 
下圖可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)4min反應(yīng)后，Bensonase®內(nèi)切酶對(duì)于核酸的切割效率。 在病毒疫苗的澄清工藝中，根據(jù)不同的細(xì)胞培養(yǎng)方式、病毒類(lèi)型、病毒原液收獲模式，默克Millistak+® Pod深層濾器和PolysepTM II表面濾器都可以很好的滿(mǎn)足工藝需求，并可實(shí)現(xiàn)從小試到生產(chǎn)線(xiàn)性放大。而非動(dòng)物源Bensonase®核酸內(nèi)切酶，能簡(jiǎn)單快速地降低工藝過(guò)程中核酸殘留，為疫苗安全性提供了強(qiáng)有力的保障。