RT-qPCR常用的SYBR@Green I雙鏈DNA結(jié)合染料的應(yīng)用
隨著新冠病毒肆虐全球，聊病毒是個(gè)敏感話題。今天我們就從這個(gè)敏感話題著手，好好聊一聊。
病毒是一種個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，只含一種核酸（DNA或RNA）。我們現(xiàn)在提起來(lái)就咬牙切齒的的新冠病毒（COVID-19），就是一種RNA病毒。當(dāng)然除了COVID-19，我們常聽(tīng)到的其他臭名昭著之輩，如艾滋病病毒、流感病毒、登革熱病毒、煙草花葉病毒、噬菌體等均屬于RNA病毒。這些RNA病毒讓之所以讓我們談虎色變，是因?yàn)楹芏郣NA病毒具有非常強(qiáng)的侵略能力，會(huì)嚴(yán)重影響宿主生命活動(dòng)。如何精準(zhǔn)地檢測(cè)到病毒（定性）？如何有效判定出樣本中的病毒含量（定量）？借助分子生物學(xué)技術(shù)可以精準(zhǔn)檢測(cè)病原體，其中的一步法RT-qPCR技術(shù)可被廣泛用于RNA病毒類(lèi)型判定、病毒亞型判定、病毒定量及病毒突變體等方面，廣泛用于食品安全、動(dòng)物疫病、疾病診斷與治療效果評(píng)估等臨床與公共衛(wèi)生等領(lǐng)域。
一步法RT-qPCR(One-Step reverse transcription-quantitative PCR)用于以RNA為起始模板的定性和定量分析，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的過(guò)程與靶標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增于一管內(nèi)依次進(jìn)行，利用熒光來(lái)監(jiān)控PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變化，進(jìn)而判斷RNA初始量的技術(shù)即為一步法RT-qPCR技術(shù)。RT-qPCR根據(jù)化學(xué)發(fā)光原理可以分為兩大類(lèi)：一類(lèi)為染料類(lèi)，包括SYBR@Green I，通過(guò)熒光染料來(lái)指示產(chǎn)物的增加；一類(lèi)為探針類(lèi)，包括TaqMan@探針，利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。
染料法：
常用的SYBR@Green I是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常理想。SYBR@Green I 的最大吸收波長(zhǎng)約為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為520nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR@Green 熒光染料，SYBR@Green熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR@Green染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
作為全球最大的克隆供應(yīng)商之一，GeneCopoeia提供的BlazeTaq™ One-Step SYBR® Green RT-qPCR kit是基于SYBR Green 染料法的Real Time One-Step RT-PCR反應(yīng)試劑。試劑盒以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和定量檢測(cè)可在同一反應(yīng)管內(nèi)完成，簡(jiǎn)化操作的同時(shí)可有效降低污染的風(fēng)險(xiǎn)。試劑盒包含了性能優(yōu)異的逆轉(zhuǎn)錄酶，以及含有熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶、dNTP和必需的緩沖液成分混合而成的5×預(yù)混液。在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用抗體修飾的Taq DNA聚合酶進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，抗體的完全封閉有效避免了聚合酶在熱循環(huán)反應(yīng)前被激活。另外，經(jīng)優(yōu)化的Buffer體系大大提高了PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率和特異性，且檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1pg總RNA，適用于各類(lèi)型RNA模板的檢測(cè)。
一步法RT-qPCR染料法熒光定量試劑盒優(yōu)勢(shì)：
靈敏度高：可從低至0.1pg的RNA提取物中精確檢測(cè)目標(biāo)RNA。
特異性強(qiáng)：有效抑制引物二聚體及非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生。
擴(kuò)增效率高：在寬廣的GC含量范圍內(nèi)能維持高擴(kuò)增效率。
一步法RT-qPCR染料法熒光定量試劑盒：
| 貨號(hào) | 名稱(chēng) | 規(guī)格 | 描述 |
| QP071 | BlazeTaq One-Step SYBR Green RT-qPCR Kit (with ROX) | 200rxn | 新型real-time RT-PCR專(zhuān)用試劑，包含反轉(zhuǎn)錄酶、Hot-Start DNA聚合酶、經(jīng)嚴(yán)格優(yōu)化的反應(yīng)buffer、dNTPs，以及 ROX參比染料 |
| QP072 | 600rxn | ||
| QP073 | 1200rxn | ||
| QP081 | BlazeTaq One-Step SYBR Green RT-qPCR Kit (200 rxn, w/o ROX) | 200rxn | 新型real-time RT-PCR專(zhuān)用試劑，包含反轉(zhuǎn)錄酶、Hot-Start DNA聚合酶、經(jīng)嚴(yán)格優(yōu)化的反應(yīng)buffer、dNTPs |
| QP082 | 600rxn | ||
| QP083 | 1200rxn |
圖3. 使用一步法RT-qPCR染料法熒光定量試劑盒，對(duì)HeLa細(xì)胞RNA提取物中GAPDH和Actin水平進(jìn)行分析，RNA提取物以10倍梯度稀釋成7個(gè)樣本，總量的范圍為100 ng至0.1 pg，并設(shè)無(wú)模板對(duì)照（NTC組）。 A.GAPDH的擴(kuò)增曲線（紅色）； B.Actin的擴(kuò)增曲線（藍(lán)色）； C.GAPDH（紅色）和Actin（藍(lán)色）擴(kuò)增片段的熔解曲線。
圖2. 一步法RT-qPCR染料法熒光定量試劑盒（紅色）與Competitor T試劑盒（藍(lán)色）產(chǎn)品的性能比較。對(duì)HeLa細(xì)胞RNA提取物中GAPDH和Actin水平進(jìn)行分析，RNA提取物以10倍梯度稀釋成7個(gè)樣本，總量的范圍為100 ng至0.1 pg。 A.HeLa細(xì)胞提取物中GAPDH擴(kuò)增曲線的比較； B.HeLa細(xì)胞提取物中Actin擴(kuò)增曲線的比較。
探針?lè)ǎ?/div>
PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。再通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程熒光信號(hào)的積累，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比進(jìn)行定量分析。
作為全球最大的克隆供應(yīng)商之一，GeneCopoeia提供的BlazeTaq™ Probe One-Step RT-qPCR kit是基于探針?lè)ǖ腞eal Time One-Step RT-PCR反應(yīng)試劑。試劑盒以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和定量檢測(cè)可在同一反應(yīng)管內(nèi)完成，簡(jiǎn)化操作的同時(shí)可有效降低污染的風(fēng)險(xiǎn)。試劑盒包含了性能優(yōu)異的逆轉(zhuǎn)錄酶，以及含有熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶、dNTP和必需的緩沖液成分混合而成的5×預(yù)混液。在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，在DNA擴(kuò)增期間，與DNA上的靶點(diǎn)結(jié)合的靶特異性探針被Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，報(bào)告基團(tuán)釋放并發(fā)出熒光。
一步法RT-qPCR探針?lè)ǘ吭噭┖校?/div>
三點(diǎn)：
| 貨號(hào) | 名稱(chēng) | 規(guī)格 | 描述 |
| QP076 | BlazeTaq Probe One-Step RT-qPCR Kit ( with ROX) | 200rxn | 新型real-time RT-PCR專(zhuān)用試劑，包含反轉(zhuǎn)錄酶、Hot-Start DNA聚合酶、經(jīng)嚴(yán)格優(yōu)化的反應(yīng)buffer、dNTPs，以及 ROX參比染料 |
| QP077 | 600rxn | ||
| QP078 | 1200rxn | ||
| QP086 | BlazeTaq Probe One-Step RT-qPCR Kit ( w/o ROX) | 200rxn | 新型real-time RT-PCR專(zhuān)用試劑，包含反轉(zhuǎn)錄酶、Hot-Start DNA聚合酶、經(jīng)嚴(yán)格優(yōu)化的反應(yīng)buffer、dNTPs |
| QP087 | 600rxn | ||
| QP088 | 1200rxn |
圖1. 一步法RT-qPCR探針?lè)ǘ吭噭┖校t色）與Competitor P試劑盒（藍(lán)色）產(chǎn)品的性能比較。使用BlazeTaq™ Probe One-Step RT-qPCR kit，對(duì)HeLa細(xì)胞RNA提取物中ACTB(A)、GAPDH(B)和B2M(C)水平進(jìn)行分析，RNA提取物以10倍梯度稀釋成6個(gè)樣本，總量的范圍為10 ng至0.1 pg。
圖2. 使用BlazeTaq™ Probe One-Step RT-qPCR kit，對(duì)HeLa細(xì)胞RNA提取物中ACTB(A)、GAPDH(B)和B2M(C)水平進(jìn)行單通道和三通道分析，RNA提取物以10倍梯度稀釋成7個(gè)樣本，總量的范圍為100 ng至0.1 pg，結(jié)果顯示，單通道和三通道的擴(kuò)增效率相同。
艾美捷科技有限公司，通過(guò)提供完整的產(chǎn)品和服務(wù)體系、便利的客戶(hù)關(guān)系和供應(yīng)鏈管理，為生命科學(xué)研究工作者提供整體打包方案。我們的企業(yè)的核心價(jià)值觀：“激情、敬業(yè)、學(xué)習(xí)、創(chuàng)新、合作、卓越”。作為一家具有尖端的技術(shù)實(shí)力、一流的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷(xiāo)售體系的生物高科技企業(yè)，總部位于武漢光谷國(guó)家級(jí)高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)，服務(wù)面向全國(guó)。艾美捷科技是集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷(xiāo)售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專(zhuān)業(yè)化高科技公司，為用戶(hù)提供最前沿的專(zhuān)業(yè)資訊、完備的產(chǎn)品、整合的解決方案，及優(yōu)質(zhì)的物流服務(wù)。為了更好的服務(wù)客戶(hù)，公司組建了一支經(jīng)驗(yàn)豐富的研發(fā)團(tuán)隊(duì)-艾美捷生物技術(shù)中心，進(jìn)入研發(fā)生產(chǎn)階段，將更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品推薦給國(guó)內(nèi)生物領(lǐng)域的同仁們!
艾美捷科技與國(guó)內(nèi)外優(yōu)秀的生物試劑供應(yīng)商保持著密切的合作關(guān)系，目前已成為眾多國(guó)際知名品牌的中國(guó)總代理或一級(jí)代理，主要包括：AmyJet、AAT Bioquest、Abnova、Agrisera、Biovision、Biosensis、Cayman Chemical、Caisson Labs、Cytoskeleton、Epigentek、Equitech-Bio、Hycult Biotech、Jackson、LifeSensors、ProSpec、Norgen Biotek、Mabtech、iRegene、StressMarq、ImmunoReagents、SouthernBiotech、Origene、US Biological、Solis BioDyne、CytoNiche、Matreya LLC等，可以在第一時(shí)間為用戶(hù)提供最前沿的專(zhuān)業(yè)資訊、完備的產(chǎn)品及物流服務(wù)。免費(fèi)電話：400-6800-868 電子郵件：sales@amyjet.com 網(wǎng)站：www.amyjet.com
三點(diǎn)：
企業(yè)使命：激發(fā)我們內(nèi)在的創(chuàng)造力，提供有競(jìng)爭(zhēng)力的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品和服務(wù)，持續(xù)為客戶(hù)創(chuàng)造最大價(jià)值。
企業(yè)愿景：成為受人尊重、世界一流的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品及服務(wù)供應(yīng)商。
艾美捷定位：通過(guò)提供完整的產(chǎn)品和服務(wù)體系、便利的客戶(hù)關(guān)系和供應(yīng)鏈，為生命科學(xué)研究工作者提供整體打包方案。
六觀
價(jià)值觀：激情、敬業(yè)、學(xué)習(xí)、創(chuàng)新、合作、卓越。
企業(yè)愿景：成為受人尊重、世界一流的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品及服務(wù)供應(yīng)商。
艾美捷定位：通過(guò)提供完整的產(chǎn)品和服務(wù)體系、便利的客戶(hù)關(guān)系和供應(yīng)鏈，為生命科學(xué)研究工作者提供整體打包方案。
六觀
價(jià)值觀：激情、敬業(yè)、學(xué)習(xí)、創(chuàng)新、合作、卓越。
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