AAT最亮的鈣離子熒光探針Calbryte的多種運(yùn)用

百螢推薦：AAT最亮的鈣離子熒光探針Calbryte系列產(chǎn)品

AAT Bioquest研發(fā)生產(chǎn)的最亮的鈣離子熒光探針Calbryte系列產(chǎn)品（代表產(chǎn)品：Calbryte 520、Calbryte 590 、 Calbryte 630）。Calbryte 系列是開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光染料家族。這些指示劑的主要區(qū)別在于它們的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，它們均可以使用標(biāo)準(zhǔn)的熒光儀器進(jìn)行檢測(cè)。Calbryte 系列已經(jīng)經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可用于熒光顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀，它們還可以用于高通量篩選應(yīng)用。感興趣的朋友一起來(lái)看看吧！

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Calbryte 系列染料與常見(jiàn)的Fluo-3和Fluo-4染料相比具有幾個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì) 。Calbryte 系列染料能產(chǎn)生更亮的信號(hào)，具有更優(yōu)秀的信噪比，并大大增強(qiáng)了細(xì)胞保留能力。這些特點(diǎn)使Calbryte 系列染料成為傳統(tǒng)的鈣指示劑的絕佳替代品。
 

圖1.在Fluo-4，AM（左）和Calbryte 520AM（右）的CHO-K1細(xì)胞中測(cè)量ATP反應(yīng)。將CHO-K1細(xì)胞以50,000個(gè)細(xì)胞/ 100 µL /孔在黑色96孔板中接種過(guò)夜。加入含丙磺舒的HH緩沖液中的100 µL 10 µg / ml Calbryte 520 AM或含丙磺舒的HH緩沖液中的10 µg / ml Fluo-4，AM，并在37°C下孵育45分鐘。然后除去染料加載溶液，并用200 µL HH Buffer /孔替換。加入ATP（50 µL /孔）以達(dá)到最終指示的10 µM濃度，然后用顯微鏡FITC通道（Keyence）成像。

 

Calbryte系列產(chǎn)品的命名

Calbryte 系列的染料是根據(jù)其最大發(fā)射波長(zhǎng)命名的。例如，Calbryte 520在可見(jiàn)光譜的綠色區(qū)域發(fā)出熒光，而Calbryte 590和Calbryte 630在紅色和深紅色區(qū)域發(fā)出熒光。它們共有AM酯形式、鹽形式（以鉀鹽形式）。AM酯形式是可滲透細(xì)胞的形式，可用于檢測(cè)活細(xì)胞中的鈣離子。鹽形式主要用于校準(zhǔn)鈣指示劑。根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算細(xì)胞內(nèi)鈣濃度時(shí)，通常需要執(zhí)行此步驟。鹽形式的Calbryte 也可以用于向活細(xì)胞和組織中進(jìn)行顯微注射。

 

Calbryte系列產(chǎn)品在活細(xì)胞中的作用機(jī)制

當(dāng)測(cè)定活細(xì)胞中的鈣離子時(shí)，合成具有幾個(gè)乙酰氧基甲基酯（AM酯）官能團(tuán)的Calbryte 染料。這樣做的原因有兩個(gè)。首先，AM酯是親脂性基團(tuán)，當(dāng)連接到Calbryte 核心結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)形成整體上更疏水的化合物。這種增加的疏水性使Calbryte AM酯易于滲透完整的脂質(zhì)膜并滲透到活細(xì)胞中。這消除了對(duì)電穿孔、顯微注射或其他類似破壞性加載技術(shù)的需求；其次，Calbryte 染料雖然呈AM酯形式，但基本上是非熒光性且不可活化的。它們對(duì)存在于細(xì)胞外溶液中的微量Ca²⁺表現(xiàn)出最小的響應(yīng)。只有當(dāng)Calbryte 探針滲透到細(xì)胞中，并且只有在細(xì)胞內(nèi)酯酶切割掉AM酯官能團(tuán)之后，Calbryte 染料才被激活并對(duì)鈣離子有反應(yīng)。這兩步激活過(guò)程非常重要，因?yàn)樗鼧O大地減少了非特異性背景熒光。并且通過(guò)擴(kuò)展，它明顯增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)；最后，一旦激活了Calbryte 探針，它就會(huì)通過(guò)典型的螯合過(guò)程檢測(cè)細(xì)胞中鈣的鈣離子。但是，與其他螯合劑（例如Fluo-3和Fluo-4）不同，Calbryte 染料在與鈣結(jié)合時(shí)會(huì)表現(xiàn)出更大的響應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中，Calbryte 探針在螯合后會(huì)表現(xiàn)出大于300倍的熒光增加。相比之下，F(xiàn)luo-4僅表現(xiàn)出100倍的增長(zhǎng)。熒光響應(yīng)的這種明顯改善，使這種新型鈣離子檢測(cè)探針Calbryte對(duì)鈣的檢測(cè)極為穩(wěn)定，這是過(guò)去的鈣指示劑無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。

 

Calbryte系列產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)

在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Calbryte 染料的信噪比比其他染料（例如Fluo-4）大一個(gè)數(shù)量級(jí)，在實(shí)驗(yàn)研究中，這是一個(gè)巨大的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檩^差的信噪比對(duì)數(shù)據(jù)分析來(lái)說(shuō)是非常頭疼的問(wèn)題。它將結(jié)果與其他信號(hào)混在一起，可能會(huì)遺失掉許多重要數(shù)據(jù)，并導(dǎo)致巨大的測(cè)定差異。因此，在選擇試劑時(shí)，大多數(shù)研究人員更喜歡信噪比高的試劑。

信噪比不佳可能是由多種因素造成的，這些因素主要分為兩類。第一類，存在導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度差的因素。這些可以包括：

1. 低消光系數(shù)和量子產(chǎn)率
2. 與目標(biāo)結(jié)合不佳
3. 遠(yuǎn)離激發(fā)光源的最大吸光度（_λmax）

Catbryte 系列染料的開(kāi)發(fā)，完美的解決了以上問(wèn)題。例如，Calbryte 520的量子產(chǎn)率是Fluo-3和Fluo-4的三倍。這意味著Calbryte 520吸收的每個(gè)光子從根本上比Fluo-3或Fluo-4發(fā)出更多的熒光，從而產(chǎn)生更亮的熒光信號(hào)。此外，所有Calbryte 系列染料的設(shè)計(jì)均應(yīng)使其最大吸收率發(fā)生在標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)源附近。例如，Calbryte 520（_λmax  = 492 nm）被常見(jiàn)的488 nm氬離子激發(fā)光線激發(fā)。

許多探針表現(xiàn)出較差的信噪比的第二個(gè)原因是由于高背景。高背景可能是由于以下原因造成的：

1. 細(xì)胞不滲透
2. 高自發(fā)熒光
3. 非特異性激活/結(jié)合
4. 細(xì)胞內(nèi)保留性差

這些因素中的許多與探針進(jìn)入細(xì)胞并有效定位于細(xì)胞質(zhì)的能力有關(guān)�？v觀過(guò)去的許多鈣指示劑，它們經(jīng)常遇到兩個(gè)問(wèn)題：1.探針要么是相當(dāng)水溶性的，但太親水而不能滲透活細(xì)胞，要么是疏水性足夠滲透活細(xì)胞，但水溶性太差，在加載過(guò)程中會(huì)從溶液中沉淀出來(lái)，這兩種情況都不可取。Calbryte 系列熒光染料通過(guò)控制水溶性官能團(tuán)和前面提到的AM酯基來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)優(yōu)化，Calbryte 染料能夠獲得更高的信噪比。

圖3.CHO-K細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體對(duì)ATP的反應(yīng)。將CHO-K細(xì)胞以每100 µL 40,000個(gè)細(xì)胞的孔接種在黑色96孔板中過(guò)夜。將含有2 mM丙磺舒的HHBS中的100 µL Calbryte 520 AM（左），Calbryte 590 AM（中）或Calbryte 630 AM（右）加入孔中，并將細(xì)胞在37°C下孵育1小時(shí)。將染料加載介質(zhì)替換為200 µL HHBS，用50 µL 50 µM ATP處理，并使用FITC通道（Calbryte 520），TRITC通道（Calbryte 590）或Texas Red通道Calbryte 630），用熒光顯微鏡成像（Keyence）。

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