人肺類(lèi)器官在COVID-19新冠藥物篩選中的運(yùn)用
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2020年5月5日，由美國(guó)康奈爾醫(yī)院的Yuling Han團(tuán)隊(duì)在生物學(xué)預(yù)印本bioRxiv中發(fā)表的題為《Identification of Candidate COVID-19 Therapeutics using hPSC-derived Lung Organoids》的文章，全球首次報(bào)道了用肺類(lèi)器官模型研究COVID-19及其治療藥物的篩選。 |
| Part 1 誘導(dǎo)hPSC分化為肺類(lèi)器官，肺類(lèi)器官組織對(duì)SARS-CoV-2偽病毒感染敏感，且體內(nèi)外研究結(jié)果一致 |
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研究人員們使用多種細(xì)胞因子及小分子組合體外定向誘導(dǎo)hPSC分化，使之分化為定型內(nèi)胚層(DE)，再分化為前腸內(nèi)胚層(AFE)（前腸內(nèi)胚層含肺部祖細(xì)胞(LPs) )，最終誘導(dǎo)其分化為肺類(lèi)器官。通過(guò)分析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征，鑒定肺類(lèi)器官細(xì)胞類(lèi)型，如II型肺泡細(xì)胞(AT2細(xì)胞, SP-B+SP-D+ABCA3+)、I型肺泡細(xì)胞(AT1細(xì)胞, PDPN+APQ5+)、基質(zhì)細(xì)胞、增殖細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(ASCL1+CALCA+)以及氣道上皮細(xì)胞等(圖1a)。
 圖1d ACE2和TMPRSS2在AT2細(xì)胞的表達(dá)(SFTPB、SFPTD和 ABCA3為AT2細(xì)胞的表面標(biāo)志物)
研究人員使用表達(dá)SARS-CoV-2刺突糖蛋白的水皰性口炎病毒(VSV) - SARS-CoV-2偽病毒感染肺類(lèi)器官。熒光素酶(LUC)活性檢測(cè)結(jié)果顯示SARS-CoV-2偽病毒能輕松入侵人hPSC誘導(dǎo)的肺類(lèi)器官(圖1f)。  圖1f ARS-CoV-2偽病毒感染肺類(lèi)器官熒光素酶(LUC)活性檢測(cè)結(jié)果 為了研究人類(lèi)肺器官的體內(nèi)模型，研究人員將體外培養(yǎng)了25天的肺祖細(xì)胞(LPs)注射到免疫缺陷的NSG小鼠皮下，待其生長(zhǎng)分化4個(gè)月后(圖1g)，成為具有肺泡組織樣結(jié)構(gòu)(圖1h)的異種移植體。免疫熒光染色結(jié)果顯示，在異種移植體中存在大量表達(dá)ACE2的SP-B+AT2細(xì)胞(圖1i)。  圖1g-i 小鼠體內(nèi)LPs誘導(dǎo)形成肺泡組織及組織內(nèi)AT2細(xì)胞鑒定
研究人員將SARS-CoV-2偽病毒注射入移植體，24小時(shí)后檢測(cè)到SP-B+AT2細(xì)胞熒光素酶(LUC)的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(圖1j)。LPs誘導(dǎo)形成的肺異種移植體對(duì)SARS-CoV-2病毒感染同樣敏感。  圖1j SARS-CoV-2偽病毒感染肺異種移植體 Part 2 研究人員將肺類(lèi)器官與SARS-CoV-2共培養(yǎng)，考察SARS-CoV-2感染肺類(lèi)器后病理變化，感染24小時(shí)后，肺類(lèi)器官中SARS-CoV-2 DNA及SARS-S蛋白含量顯著升高(圖2a,b)，RNA序列檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了SARS-CoV-2的強(qiáng)勁復(fù)制。研究人員還發(fā)現(xiàn)肺類(lèi)器官中趨化因子及細(xì)胞因子表達(dá)顯著上調(diào)，但并未檢測(cè)到I型和III型IFNs。
 圖2 a,b 肺類(lèi)器官中SARS-CoV-2 DNA及SARS-S蛋白含量檢測(cè)結(jié)果基因集合富集分析(GSEA)結(jié)果顯示，感染的肺類(lèi)器官多條信號(hào)通路上調(diào)，如TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等，其中IL-17信號(hào)通路的上調(diào)與COVID-19患者肺組織的檢測(cè)結(jié)果相一致(圖2f, h)。以上研究結(jié)果均表明人肺類(lèi)器官模型可以作為研究SARS-CoV-2感染以及致病機(jī)制的工具。
 圖2f hPSC誘導(dǎo)的肺類(lèi)器官與對(duì)照組相比不同信號(hào)通路基因過(guò)表達(dá)分析  圖2h COVID-19患者與健康者相比不同信號(hào)通路基因過(guò)表達(dá)分析 Part 3
使用hPSC來(lái)源的肺類(lèi)器官篩選治療COVID-19的候選藥物 為了明確能夠阻斷SARS-CoV-2偽病毒感染的候選藥物，研究人員將hPSC來(lái)源的肺類(lèi)器官轉(zhuǎn)移至384孔板，培養(yǎng)6小時(shí)使其成團(tuán)。選擇FDA批準(zhǔn)的藥物以10 μM的濃度處理2小時(shí)后，將SARS-CoV-2偽病毒與肺類(lèi)器官共培養(yǎng)，24小時(shí)后對(duì)類(lèi)器官進(jìn)行熒光素酶活性分析。選擇Z值<-2孔使用的藥物為候選藥物。對(duì)不同濃度的候選藥物進(jìn)行藥物效力和細(xì)胞毒性分析(圖3e, f, g)。imatinib、mycophenolic acid(MPA)和quinacrine dihydrochloride(QNHC)三種藥物被證實(shí)不依賴(lài)于細(xì)胞毒性，以劑量依賴(lài)的方式阻斷SARS-CoV-2偽病毒感染。
 圖2e, f, g Imatinib, MPA, QNHC效力及細(xì)胞毒性檢測(cè)曲線 免疫熒光染色結(jié)果顯示，使用10 μM imatinib、3μM MPA或4.5 μM QNHC處理肺類(lèi)器官，可顯著降低SARS-CoV-2偽病毒的感染率(圖3h)。  圖3h SARS-CoV-2偽病毒感染imatinib, MPA, QNHC處理過(guò)的肺類(lèi)器官 為了評(píng)估藥物在體內(nèi)的抗病毒感染活性，研究人員將LPs注射到NSG小鼠皮下，待其4個(gè)月生長(zhǎng)成熟后，將imatinib、MPA和QNHC分別注射入異種移植體內(nèi)，三小時(shí)后使用SARS-CoV-2偽病毒感染該移植體(圖3i)。24小時(shí)的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，三種藥物均能阻止SARS-CoV-2偽病毒對(duì)AT2細(xì)胞的感染(圖3j)。
 圖3i LPs誘導(dǎo)形成肺泡組織的小鼠體內(nèi)給藥方案
 圖3j 體內(nèi)給藥后，SARS-CoV-2偽病毒感染肺異種移植體 類(lèi)器官因其在結(jié)構(gòu)組織及功能上與體內(nèi)組織器官高度相似，可用于體外模擬體內(nèi)生理病理變化過(guò)程，因此選擇人肺類(lèi)器官做為COVID-19藥物篩選的工具將會(huì)更加便捷。目前，已有三個(gè)使用imatinib治療COVID-19患者的臨床試驗(yàn)(NCT04346147, NCT04357613，NCT04356495)注冊(cè)。使用類(lèi)器官進(jìn)行藥物篩選的研究可以更好地為臨床試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)支持。
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