PCR疑難問(wèn)題解答第二篇：熒光定量PCR

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【前情回顧】PCR疑難問(wèn)題粉碎機(jī)（一）——終點(diǎn)PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定性及定量分析。目前它主要通過(guò)兩種方式——熒光染料或者熒光標(biāo)記的探針對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，并結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。

熒光定量PCR，qPCR

熒光染料法

在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量熒光染料，該染料只與雙鏈DNA小溝結(jié)合，并不與單鏈DNA鏈結(jié)合，而且在游離狀態(tài)不發(fā)出熒光，只有摻入DNA雙鏈中才可以發(fā)光，因此，在PCR體系中，隨著特異性PCR產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。

武漢艾美捷科技專注為客戶提供整體打包方案，可提供EvaGreen、SolisGreen和SYBR等多種染料qPCR預(yù)混液。

EvaGreen、SolisGreen、SYBR染料

熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現(xiàn)在最常用的SYBR GreenⅠ,EvaGreen、SolisGreen屬于飽和熒光染料。非飽和熒光染料在濃度高的時(shí)候會(huì)對(duì)PCR過(guò)程產(chǎn)生抑制，所以在熒光定量實(shí)驗(yàn)時(shí)使用濃度稍低，染料不能占據(jù)DNA雙鏈上的所有位置。當(dāng)PCR隨著溫度上升，雙鏈逐漸解鏈，染料會(huì)從已解開(kāi)的單鏈上脫落，然后結(jié)合到臨近的尚未解鏈的雙鏈中去繼續(xù)發(fā)熒光。這種染料重排導(dǎo)致在較小的溫度變化內(nèi)，雖然DNA雙鏈的解鏈過(guò)程不同，但熒光值是幾乎不變的，也就是說(shuō)，其溶解曲線不能精確反應(yīng)雙鏈的解鏈情況。

所以，對(duì)于非飽和染料，其溶解曲線分辨率相對(duì)較低，只能區(qū)分特異性的產(chǎn)物，不能分辨單堿基的差異。飽和熒光染料在DNA雙鏈中所有可結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)都會(huì)有染料分子存在，染料與DNA的結(jié)合呈飽和狀態(tài)，隨著溫度上升，在雙鏈解鏈、染料脫離過(guò)程中，未解鏈的雙鏈部分不存在染料可以結(jié)合的位點(diǎn)，染料不能發(fā)生重排。所以使用飽和染料制作的溶解曲線分辨率很高，可以精確反映DNA雙鏈隨著溫度的解鏈情況，精度可以達(dá)到單堿差異的區(qū)分。

熒光標(biāo)記的探針?lè)?/div>

PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對(duì)引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，PCR 儀檢測(cè)不到熒光信號(hào)； PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段），Taq 酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，這也是定量的基礎(chǔ)所在。

染料法VS探針?lè)?/div>

1.探針?lè)ㄍㄟ^(guò)探針可以增加反應(yīng)收集信號(hào)的特異性，只有探針結(jié)合的片段上發(fā)生擴(kuò)增才能收集到信號(hào)，探針?lè)軌蛴枚嘀伢w系反應(yīng)，能夠預(yù)測(cè)和提前進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，缺點(diǎn)是要合成探針，成本高

2.染料法經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，可以做溶解曲線，分析全部PCR產(chǎn)物的TM值，缺點(diǎn)就是特異性沒(méi)有探針?lè)ê?/div>

類型		貨號(hào)	名稱
染料法	EvaGreen染料	08-36-00001	5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix 5×qPCR 預(yù)混液
		08-24-00001	5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (ROX) 5×qPCR預(yù)混液,ROX
		08-25-00001	5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (no ROX) 5×qPCR預(yù)混液,無(wú)ROX
		08-26-00001	5×HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Mix Plus (Capillary) 5×qPCR預(yù)混液,Capillary
	SolisGreen染料	28-41-00001	SolisFAST™ SolisGreen® qPCR Mix (no ROX) 5×qPCR預(yù)混液,ROX
	SolisGreen染料	28-46-00001	SolisFAST™ SolisGreen® qPCR Mix (ROX) 5×qPCR預(yù)混液,無(wú)ROX
	SYBR染料	QP031	qPCR預(yù)混液2.0,ROX
	SYBR染料	QP041	qPCR預(yù)混液2.0,無(wú)ROX
探針?lè)?/strong>	08-17-00001		5×HOT FIREPol ® Probe Universal qPCR Mix
	QP036		5×探針qPCR預(yù)混液,ROX
	QP046		5×探針qPCR預(yù)混液,無(wú)ROX
	08-16-00001		5×HOT FIREPol® Probe qPCR Mix Plus (Capillary)
	多重qPCR	08-01-00001	5x HOT FIREPol® Multiplex qPCR Mix 5x多重探針qPCR預(yù)混液
		08-02-00001	5x HOT FIREPol® Multiplex qPCR Mix (Rox) 5x多重探針qPCR預(yù)混液,Rox
		08-03-00001	5x HOT FIREPol® Multiplex qPCR Mix (Purple) 5x多重探針qPCR 預(yù)混液,Purple
	快速qPCR	28-21-00001	SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (no ROX) 快速探針qPCR預(yù)混液,含UNG,無(wú)ROX
		28-22-00001	SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (ROX) 快速探針qPCR預(yù)混液,含UNG,ROX
		28-23-00001	SolisFAST™ Probe qPCR Mix with UNG (Purple) 快速探針qPCR預(yù)混液,含UNG,Purple
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qPCR系統(tǒng)知識(shí)匯總

在qPCR 技術(shù)中重要的參數(shù)指標(biāo)有哪些？

擴(kuò)增及溶解曲線：擴(kuò)增曲線是PCR過(guò)程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所繪制的曲線。主要用于反映qPCR的動(dòng)態(tài)進(jìn)程；溶解曲線是用來(lái)驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的，如果產(chǎn)物是單一條帶，溶解曲線就會(huì)出現(xiàn)單峰，如果有引物二聚體或其它非特異性擴(kuò)增，就會(huì)出現(xiàn)至少兩個(gè)峰。

熒光域值（threshold）: 是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold。

Ct 值：是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋進(jìn)行qPCR，按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴(kuò)增曲線。Ct值與起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)值之間存在線性關(guān)系，可以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知濃度的樣品也得到Ct值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以求出未知樣品的起始模板量。

擴(kuò)增曲線一般分為哪幾個(gè)階段

熒光擴(kuò)增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。在qPCR擴(kuò)增早期，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化，此時(shí)即為基線期，

PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板，從而進(jìn)入平臺(tái)期，在該時(shí)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無(wú)線性關(guān)系，只有在熒光信號(hào)的指數(shù)增長(zhǎng)期，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。

ROX染料是什么作用？

ROX（Passive Reference Dye）是一種惰性參比染料，在qPCR反應(yīng)中能被qPCR儀檢測(cè)到。ROX不參與qPCR反應(yīng)，熒光信號(hào)值不會(huì)隨著qPCR擴(kuò)增而改變。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中很多因素會(huì)引起孔間差異：不均勻的照明，孔與孔之間光學(xué)因素（液滴、氣泡）的因素，反應(yīng)體系的濃度不同…… 可以用ROX作為陽(yáng)性參比，對(duì)其他熒光信號(hào)進(jìn)行歸一化校正，以提高數(shù)據(jù)的精確度。

Ct值多少才算理想

一般來(lái)說(shuō)Ct值在30以下都可以說(shuō)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的，30以上基本可以說(shuō)明該基因沒(méi)有擴(kuò)增，但也不是絕對(duì)的，需要輔以溶解曲線加以解釋。

*** qPCR 常見(jiàn)問(wèn)題分析 ***

問(wèn)題類型	原因分析
無(wú)Ct值出現(xiàn)	* 檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時(shí)采集，探針?lè)▌t一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)； * 引物或探針降解：可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性； * 模板量不足：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起； * 模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況
Ct 值出現(xiàn)過(guò)晚（Ct>38）	* 擴(kuò)增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，設(shè)計(jì)更好的引物或探針、適當(dāng)降低退火溫度、增加鎂離子濃度等； * PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量不足； * PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度
標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳	* 加樣存在誤差：使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度； * 標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解：應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品 * 引物或探針不佳：重新設(shè)計(jì)更好的引物和探針； * 模板中存在抑制物，或模板濃度過(guò)高
擴(kuò)增曲線異常，比如 S 型曲線	* 參比染料設(shè)定不正確：預(yù)混液不加參比染料時(shí)，選NONE； * 模板的濃度太高或者降解； * 熒光染料的降解
負(fù)對(duì)照有信號(hào)、溶解曲線不止一個(gè)主峰	* 引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn) * 引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比 * 鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix 試劑盒；
擴(kuò)增效率低	* 反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解； * 反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度； * 反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響

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