AAV腺病毒純化完整和空殼分離新辦法

瀏覽次數(shù)：360　發(fā)布日期：2020-6-17　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

現(xiàn)狀
基于腺相關(guān)病毒（AAV）的各種血清型載體被公認(rèn)在人類基因治療和基因疫苗接種應(yīng)用中具有高潛力。在制造AAV載體期間，不必要的，不完全的顆粒共同產(chǎn)生。它們?nèi)狈χ亟M病毒基因組，僅由空衣殼蛋白組成�？找職ぴ黾恿擞糜卺t(yī)學(xué)應(yīng)用的AAV病毒的所需劑量，并且被認(rèn)為引起針對(duì)載體衣殼的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致不必要的副作用。因此，在制造過程中去除空衣殼以及量化制劑中空AAV顆粒含量的能力是任何AAV生產(chǎn)過程的關(guān)鍵要求。
  ❀ 制備AAV載體的常規(guī)方法
目前用于制備分離空衣殼（CsCl或碘克沙醇梯度）的方法對(duì)于放大是具有挑戰(zhàn)性的并且不適合于大規(guī)模生產(chǎn)。此外，用于檢測(cè)空衣殼的分析方法和全空粒子比的測(cè)定（電子顯微鏡（EM）測(cè)定，總粒子測(cè)定[ELISA]結(jié)合基因組拷貝滴定[qPCR]）耗費(fèi)時(shí)間和勞動(dòng)力，受操作者的影響技術(shù)或不提供用于不同血清型AAV的容易獲得的試劑。
  ❀新突破
本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了利用微小電荷差異分離全空和空AAV8顆粒的新方法。通過在BIA Seperations 的CIMmultus™ QA Monolithic column整體柱上使用線性梯度洗脫，引入了用于分析AAV顆粒的簡(jiǎn)單，快速和可重復(fù)的分析。該方法成功應(yīng)用于通過兩種不同制造工藝制備的AAV8顆粒。

材料與方法
通過CsCl梯度離心制備純化的完整和空AAV8載體顆粒的病毒制劑。
通過切向流過濾（TFF）然后通過碘克沙醇梯度進(jìn)行AAV8的替代制備。

結(jié)果
電子顯微鏡
通過電子顯微鏡分析AAV8制劑制劑中完全和空顆粒的存在。空殼用箭頭表示（圖1）。

全衣殼和空殼AAV顆粒的色譜分離
用完整和空AAV8載體顆粒的CsCl梯度制備物進(jìn)行初始結(jié)合 - 洗脫實(shí)驗(yàn)。線性鹽梯度下的不同保留體積表明可以對(duì)全載體和空載體顆粒進(jìn)行色譜分離（數(shù)據(jù)未顯示）。
基于這些結(jié)果，將全粒子和空粒子的混合物應(yīng)用于CIMmultus™ QA Monolithic column整體柱（圖2）。將任意體積的75μL空衣殼制劑與1×10 12 GC的含有93.7％完整AAV載體顆粒（通過EM測(cè)量）的制劑混合（圖2）。

  檢測(cè)到代表空衣殼和完整衣殼的明顯可區(qū)分的峰。后來的洗脫峰含有> 99％的負(fù)載的全顆粒（通過qPCR測(cè)定）。空衣殼的計(jì)算相對(duì)量（根據(jù)測(cè)量的峰面積）為34％（圖2）。
然后使用AAV8衣殼的色譜分離來分析不同AAV制劑中的全粒子與空粒子比率。基于色譜峰積分，通過CsCl梯度（通過EM測(cè)量的93.7％飽和度）對(duì)AAV制劑的定量導(dǎo)致空 - 滿比率為0.016（1.6％空顆粒），而0.067（空顆粒為6.28％）由EM分析確定（數(shù)據(jù)未顯示）。

通過替代方法產(chǎn)生的AAV顆粒的色譜分離和定量
接下來評(píng)估基于CIM QA的分離和定量的適用性，用于替代的AAV制備（通過TFF制備，隨后是碘克沙醇梯度）。將含有相當(dāng)于5×10 12 GC的AAV制劑加載到CIMmultus™ QA Monolithic column上，并用線性梯度洗脫分離，如色譜圖所示（圖3）。與由CsCl制備的AAV相比，加載的AAV顆粒多5倍（圖2），這導(dǎo)致洗脫峰變寬。在20.0分鐘洗脫的次要峰的峰面積與在22.2分鐘洗脫的主峰的積分（圖3）表明空 - 滿比為0.026（2.5％空顆粒），與EM獲得的比例很好地一致（空 - 滿比率為0.05;空顆粒為4.5％）。

為了證明該方法對(duì)不同AAV生產(chǎn)過程的適用性，AAV樣品摻入空顆粒制劑，使用相同的梯度條件注入CIMmultus™ QA Monolithic column（圖4）。
分離和定量AAV顆粒（TFF和碘克沙醇梯度），加入空衣殼AAV

❀結(jié)論：
開發(fā)了一種快速，可重復(fù)的方法，用于在CIMmultus™ QA Monolithic column上通過線性梯度洗脫分離和定量空顆粒和全顆粒AAV8載體。該方案成功地用于兩種不同的AAV制劑，并且能夠定量空衣殼含量，這與替代方法一致。色譜方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單，快速，不依賴于操作員技術(shù)和需要專門的試劑。相反，它在單次測(cè)定中提供粒子特征的定量分析，運(yùn)行時(shí)間為30分鐘。