人多能性干細(xì)胞ESCs/iPSCs在誘導(dǎo)腦類器官的應(yīng)用
瀏覽次數(shù)：1264 發(fā)布日期：2020-7-2
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過去，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）藥物研究主要依賴于嚙齒動物模型或細(xì)胞體外模型等傳統(tǒng)方法。由于人類和嚙齒類動物間的物種差異，所獲得的數(shù)據(jù)難以真實地模擬神經(jīng)發(fā)育和疾病機(jī)制等。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，培養(yǎng)人大腦類器官成為目前神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域炙手可熱的研究項目。大腦類器官是模擬人腦的生理特性的獨特的工具，可用于研究正常腦與疾病腦的建模，用于闡明中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制，亦可用于神經(jīng)發(fā)育疾病的探索，或用作中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物篩選的工具。
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| 01 |腦類器官培養(yǎng)方法概述 |
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腦類器官通常從人多能性干細(xì)胞(ESCs/iPSCs)開始培養(yǎng)，自發(fā)形成腦發(fā)育早期所具備的結(jié)構(gòu)和層次。但腦細(xì)胞團(tuán)簇達(dá)到一定尺寸后，可發(fā)育的階段會受到營養(yǎng)缺乏和氧供應(yīng)的限制，繼而神經(jīng)元開始死亡，結(jié)構(gòu)停止發(fā)育。
目前，大腦類器官的培養(yǎng)主要分為兩種方法，引導(dǎo)分化法 (Guided)和非引導(dǎo) (Un-guided)分化法。
①非引導(dǎo)分化法依賴于細(xì)胞自身的形態(tài)發(fā)生和內(nèi)在的分化能力，將外在干擾最小化，得到的類器官有前腦、中腦、后腦、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)叢等多種細(xì)胞譜系，該種方法的缺陷在于高可變性和異質(zhì)性。
②而引導(dǎo)分化法是加入一些外源性的模式因子，誘導(dǎo)hPSCs分化為想要的細(xì)胞譜系。
在類器官結(jié)構(gòu)中，多能性干細(xì)胞(ESCs/iPSCs)誘導(dǎo)為擬胚體 (Embryoid Body, EB)，在外胚層形成后，引導(dǎo)分化為神經(jīng)或非神經(jīng)方向。引導(dǎo)分化法獲得的類器官依賴分化過程中添加的生長因子，大多數(shù)是腦區(qū)特異性的，如皮層、海馬、中腦、大腦等。引導(dǎo)分化法得到的類器官含有神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及其他的大腦細(xì)胞。由于是引導(dǎo)性分化，批次間的可變因素少，可以產(chǎn)生對應(yīng)比例的特異性細(xì)胞類型。很多團(tuán)隊都在嘗試用不同的方法來培養(yǎng)類器官，分別培養(yǎng)腦區(qū)特異的類器官后再將其共培養(yǎng)，類器官會自我融合形成含有不同腦區(qū)的類器官，該模型可以用于研究腦區(qū)間的相互作用。
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| 02 |3D大腦類器官的制作方法 |
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2013年，Lacaster和Knoblich等發(fā)表在Nature及Nature protocol上的3D大腦類器官的制作方法使得體外用人多能干細(xì)胞 (包括胚胎干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)誘導(dǎo)3D大腦類器官的技術(shù)前進(jìn)了一大步，他們通過使用一種允許類器官獲取能量和氧氣的新方法克服了這一局限，使用一個微小的振動刀片將類器官切成半毫米切片，然后將它們放在覆蓋富含營養(yǎng)的液體的多孔膜上。然后，類器官可同時從上方吸收氧氣，從下方吸收營養(yǎng)物質(zhì)，使其在培養(yǎng)物中繼續(xù)發(fā)育一年。圖1是該方法的概括。
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| 03 |文獻(xiàn)分享 |
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以下介紹了2014年，Lancaster發(fā)表在Nature Protocol上的“Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells”一文中從人多能性干細(xì)胞(iPSCs/ESCs)誘導(dǎo)腦類器官的方法：
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誘導(dǎo)EB形成
1-2h
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1. 當(dāng)ESCs/iPSCs在六孔板中長到融合度為70-80%時用于誘導(dǎo)EB，通常每個六孔板孔的細(xì)胞可用于誘導(dǎo)一整個96孔板。
注：干細(xì)胞克隆的形態(tài)對于大腦組織形成的成功與否非常關(guān)鍵�？寺⌒璩尸F(xiàn)多能性的特征 (如邊緣清晰，克隆緊密等)，且無分化傾向；
對于無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的ESCs/iPSCs：
① 用1ml的無鈣鎂的D-PBS洗滌細(xì)胞后，向每孔中加入600μl的含0.5mM的EDTA的無鈣鎂的D-PBS溶液。培養(yǎng)箱孵育4min；
② 輕柔吸出EDTA溶液，注意不要破壞克隆，加入1ml的Accutase。放回培養(yǎng)箱孵育4min；
③ 用1ml的mTeSR1培養(yǎng)基吹散克隆，使其從培養(yǎng)皿底部脫落。轉(zhuǎn)移2ml至15ml離心管中，用1ml移液器將克隆吹散為渾濁的單細(xì)胞懸液；
④ 270g 室溫離心細(xì)胞5min，同時用臺盼藍(lán)檢測死細(xì)胞，用血細(xì)胞儀或自動細(xì)胞計數(shù)儀細(xì)胞計數(shù)；檢測兩次取平均值；
⑤ 用1ml的含50μM的ROCK抑制劑Y-27632的低bFGF的ESCs培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打，保證細(xì)胞呈單細(xì)胞重懸的狀態(tài)。然后，用含Y-7632的低FGF-2的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為每150μl含9000個活細(xì)胞；
⑥ 每個96孔板孔中放入150μl的細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)； |
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飼養(yǎng)EB,早期胚層分化
5-7d
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2. 24h后，顯微鏡下觀察,可見有清晰邊緣的小的EB形成,邊緣有許多死細(xì)胞圍繞在EB周圍,為正�，F(xiàn)象，不會干擾EB在中間形成,繼續(xù)置于37℃的5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
3. 隔天輕柔地吸去半量培養(yǎng)基,避免干擾到EB和底部的細(xì)胞,補(bǔ)充150μl的新鮮培養(yǎng)基(總體積會大于150μl,量的準(zhǔn)確與否不重),培養(yǎng)基中添加Y-27632(1:100),FGF-2濃度為4ng/ml,直到EB直徑大于350-450μm為止,通常,僅前4天需要添加二者；
4. EB直徑達(dá)到350-600μm時，用3中的培養(yǎng)基隔天飼養(yǎng)EB,培養(yǎng)基中不含Y-27632和FGF-2； |
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原始神經(jīng)上皮的誘導(dǎo)
4-5d
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5. EB直徑達(dá)到500-600μm時，邊緣開始變得明亮，并且呈現(xiàn)光滑的邊緣 (通常為第6天)，將每個EB用剪掉槍頭的200μl移液器轉(zhuǎn)移至含有500μl的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的低吸附24孔板中，輕柔且不要破壞EB，繼續(xù)培養(yǎng)；
注：將200μl移液器槍頭剪掉，使開口直徑約為1-1.5mm。確保開口不要太小，避免破壞EB，但也不能太大，太大會難以吸去EB。不要試圖用刮刀將EB鏟出，會破壞EB的結(jié)構(gòu)；
6. 轉(zhuǎn)移至24孔板后，另外加入500μl的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基飼養(yǎng)EB；
7. 2d后，組織培養(yǎng)顯微鏡觀察EBs，形態(tài)邊緣變得更加明亮，提示神經(jīng)外胚層的分化；一旦這些區(qū)域開始顯示與神經(jīng)上皮形成一致的假復(fù)層上皮的放射狀組織，這一般發(fā)生在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的4-5d后，繼續(xù)進(jìn)行第8步，將組織聚集轉(zhuǎn)移到Matrigel液滴中；
注：健康的細(xì)胞聚集有光滑的邊緣，神經(jīng)上皮邊緣在光學(xué)上呈半透明狀。有時組織可能在光學(xué)上表現(xiàn)為非放射狀組織的半透明組織，雖然這不是理想狀態(tài)，但沒有觀察到這對類器官形成有長期的負(fù)面影響。重要的是，如果在神經(jīng)誘導(dǎo)中再多放置1-2天，這些非放射區(qū)域就會變成放射狀，但是如果不及時轉(zhuǎn)移到基質(zhì)凝膠(步驟8)，其他已經(jīng)放射狀的區(qū)域可能開始收縮并失去形成神經(jīng)上皮芽的能力。當(dāng)有神經(jīng)外胚層出現(xiàn)時，需盡快將組織轉(zhuǎn)移到Matrigel中，如果太晚，會影響腦組織的晚期形態(tài)； |
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將神經(jīng)外胚層組織轉(zhuǎn)移至Matrigel液滴中
1-2h
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8. 4℃下冰上解凍Matrigel。觀察發(fā)現(xiàn)，500μl的Matrigel在冰水混合物浴時，1-2h后會恢復(fù)液體狀態(tài)；
9. 將Parafilm膜置于一個空的帶有凹坑的中號槍頭盒上，將手指按向Parafilm膜形成凹坑，每個坑的體積約為200μl；
注：Parafilm不能高壓滅菌，所以不能徹底滅菌，因此需保證Parafilm膜保存在干凈的環(huán)境中，準(zhǔn)備凹坑前，向手套和Parafilm膜噴灑70%乙醇消毒；在這一步也可以在培養(yǎng)基中添加抗生素以避免污染；
10. 將Parafilm膜用剪刀修剪為單個含4x4(共16個)凹坑大小的正方形，將其放入60mm的組織培養(yǎng)皿中；
11. 用200μl的移液器轉(zhuǎn)移神經(jīng)外胚層組織，每個凹坑中放置1個；
注：將200μl移液器槍頭剪掉，使開口直徑約為1.5-2mm。確保開口不要太小，避免破壞EB，但也不能太大，太大會難以吸去EB。不要試圖用刮刀將EB鏟出，會破壞EB的結(jié)構(gòu)；
12. 用未剪頭部的200μl移液器小心地吸去組織邊緣多余的培養(yǎng)基；
13. 每個組織快速滴入Matrigel，每孔約30μl，使Matrigel滴入Parafilm凹坑中；
注：快速滴入Matrigel，避免組織干掉。盡量一次性滴入Matrigel，一次性包埋好16個組織；
14. 用10μl的移液槍頭移動組織，使組織位于液滴的中央，這一步需要在滴入Matrigel后立即進(jìn)行，因為室溫下Matrigel非常容易固化；
15. 將此60mm培養(yǎng)皿置入37℃培養(yǎng)箱中，孵育20-30min以使Matrigel聚合；
16. 取出60mm培養(yǎng)皿，加入5ml不含Vitamin A的腦類器官分化培養(yǎng)基；
17.將Parafilm膜反過來并搖動培養(yǎng)皿，直至Matrigel液滴從凹坑中滴入培養(yǎng)基中；不容易脫落的液滴可以用鑷子用力晃動Parafilm膜使其脫落，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)組織。 |
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神經(jīng)上皮芽的固定培養(yǎng)
4d
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18. 24h后，觀察包埋的組織，1-3d內(nèi)，組織會呈現(xiàn)包含液體空腔的進(jìn)一步擴(kuò)張的神經(jīng)上皮樣；
注：從Matrigel主體中會遷移出一些細(xì)胞類型，通常呈成纖維細(xì)胞樣，這些細(xì)胞代表了非神經(jīng)特性的群體，從神經(jīng)誘導(dǎo)時逃脫出來；然而這些細(xì)胞通常不能生存，且遷移出來后，對神經(jīng)上皮芽的形成呈現(xiàn)促進(jìn)作用；
19. 將液滴繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后將培養(yǎng)基更換為不含Vitamin A的腦類器官分化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h；
注：換液時，傾斜培養(yǎng)皿使液滴下沉，輕柔吸出培養(yǎng)液。盡量在不破壞類器官的情況下，吸出更多的培養(yǎng)液。更換為5ml的新鮮培養(yǎng)液； |
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腦組織的生長
~1年
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20. 4h的靜止培養(yǎng)后，用開口約為3mm的剪去頭部的1ml移液槍頭將包埋好的類器官轉(zhuǎn)移至125ml的震動反應(yīng)器中，加入75~100ml的含Vitamin A的腦類器官分化培養(yǎng)液，將此生物反應(yīng)器放置在培養(yǎng)箱中安裝的磁攪拌板或軌道振動篩上用85rpm的速度震動。也可以將60mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液更換為含Vitamin A的腦類器官培養(yǎng)液，將其置于軌道振動篩上培養(yǎng)；
注：每個生物反應(yīng)器中不要轉(zhuǎn)移超過2個60mm培養(yǎng)皿的類器官(32個)，太多類器官會引起類器官的融合；
使用低速攪拌攪拌板，因為常規(guī)速度的攪拌棒會因磁力攪拌而引起發(fā)熱；
軌道振動篩可用于分析多種培養(yǎng)條件，同時使用多種基因突變劑處理，而傳統(tǒng)的攪拌板只能同時防止4-6個單獨的瓶；用生物反應(yīng)器和軌道振動篩培養(yǎng)的腦類器官未觀測到有區(qū)別；
21. 振動篩上的類器官每3-4天全量換液，搖瓶上的類器官每周換液，注意觀察形態(tài)；在合適的時間點取樣本用于實驗研究； |
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PeproTech提供人腦類器官培養(yǎng)所需的各種細(xì)胞因子及小分子，并提供人ESC/iPSCs培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基及培養(yǎng)器皿包被基質(zhì)，產(chǎn)品詳情如下表：
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| 04 |參考文獻(xiàn) |
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1.Chhibber T et al.(2020). CNS organoids: an innovative tool for neurological disease modeling and drug neurotoxicity screening. Drug Discov Today Feb;25(2):456-465.
2.Lancaster, M.A. et al. (2013) Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373-379
3.Lancaster, M.A. and Knoblich, J.A. (2014) Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 9, 2329-2340.
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