人源抗體基因小鼠研發(fā)及其在治療疾病中的應(yīng)用

19世紀(jì)末，應(yīng)用動(dòng)物來源的血清治療感染性疾病，成為抗體藥物研發(fā)的最早嘗試。1975年雜交瘤技術(shù)的成功建立，極大促進(jìn)了治療性抗體的基礎(chǔ)研究發(fā)展。1986年第一個(gè)治療性鼠源抗體藥物批準(zhǔn)臨床應(yīng)用，更加速了生物醫(yī)藥企業(yè)研發(fā)以抗體為重要治療藥物的方向。

 

治療性抗體已成為目前治療腫瘤等人相關(guān)疾病的主導(dǎo)藥物。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，表達(dá)人源抗體基因小鼠模型技術(shù)平臺(tái)的成功建立，不僅是治療性抗體藥物研發(fā)的革命性創(chuàng)新，也推動(dòng)了治療性抗體作為藥物的研發(fā)及其在臨床上的廣泛應(yīng)用。過去25年來，抗體療法已經(jīng)成為臨床上治療腫瘤為主等多種人相關(guān)疾病的重要方法。特別顯著的是，2018到2019年一年，就有約18個(gè)治療性抗體新藥獲批臨床使用。

 

一．治療性抗體發(fā)展經(jīng)歷了哪些歷史階段？在治療疾病中取得了哪些里程碑成就？

19世紀(jì)末，研究者們首先證實(shí)，動(dòng)物抗白喉毒素的抗血清具有抗微生物作用，這一發(fā)現(xiàn)為抗微生物感染開創(chuàng)了新的思路。1901年，德國微生物學(xué)家Behring也因此成為獲得諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的第一人。1975年雜交瘤技術(shù)的突破性成功，使利用雜交細(xì)胞無限生產(chǎn)單克隆抗體成為可能。雜交瘤細(xì)胞技術(shù)的建立，喚醒了治療性抗體藥物研發(fā)領(lǐng)域的極大興趣。

 

1986年，第一個(gè)獲FDA批準(zhǔn)的鼠源抗CD3抗體（Orthoclone OKT3), 用于防止急性器官移植排斥反應(yīng)的治療。但該鼠源抗體因毒性較大且半衰期短，于2011年不得不退出市場。

 

1994年，第一個(gè)嵌合抗體，抗GPIIb/IIIa抗原結(jié)合片段(Fab)抗體，獲批主要用于抑制血小板凝聚相關(guān)的心血管疾病治療。該嵌合抗體是通過將小鼠抗體可變區(qū)與人抗體恒定區(qū)相結(jié)合研制而成。1997年第一個(gè)治療腫瘤的嵌合抗體，抗CD20獲批用于非霍奇金（Hodgkin）淋巴瘤治療。

 

1997年，第一個(gè)人源化抗IL-2受體抗體獲批，也是用于預(yù)防器官移植排斥反應(yīng)治療。人源化抗體的研制成功，使抗體藥物長期治療某些疾病（比如腫瘤和自身免疫性等）成為可能。1998年批準(zhǔn)的治療腫瘤的人源化抗HER2抗體 (Herceptin)，用于治療人表皮生長因子2（HER2）陽性轉(zhuǎn)移乳腺癌和胃食管交界腺癌患者。

 

2002年，第一個(gè)全人源抗體成功獲批，抗腫瘤壞死因子α(TNF-α) 抗體，是通過噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建的全人源抗體，主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其臨床應(yīng)用目前已擴(kuò)展到強(qiáng)直性脊椎炎、銀屑病、炎癥性腸病和潰瘍性結(jié)腸炎等疾病。由AbbVie公司研發(fā)的抗TNF-α抗體 (Humira) 目前不僅是抗體藥物市場中銷售排第一的大分子藥物，也2019年全球所有藥物銷售排名第一的藥物。2006年，第一個(gè)由人源抗體基因小鼠（XenoMouse)平臺(tái)研發(fā)成功的全人源抗EGFR抗體獲批，用于治療多種腫瘤。

 

近幾年來，免疫檢查點(diǎn)相關(guān)分子正在不斷引起腫瘤免疫治療研發(fā)領(lǐng)域的極大興趣與重視。 2011年，第一個(gè)針對(duì)免疫檢查點(diǎn)CTLA-4的全人源抗體(Yervoy)，是由人源抗體基因小鼠HuMabMouse平臺(tái)成功研制。2014年，針對(duì)免疫檢查點(diǎn)的全人源抗PD1抗體(Opdivo）和人源化抗PD1抗體（Keytruda) 相繼獲批，目前該兩種人源抗體已用于治療黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、頭頸部癌、霍奇金淋巴瘤和腎癌等。作為治療腫瘤抗體的“明星”藥物，該兩款抗PD1抗體也成為2018年全球抗體藥物銷量的第二和第三名，且在2019年全球所有藥物銷量排名中分別為第6和第3名。

 

治療性抗體已成為制藥市場中的最佳銷量藥物。到目前為止，全球生物醫(yī)藥企業(yè)開展的治療性抗體臨床試驗(yàn)至少有570個(gè)，其中約有近80個(gè)抗體被FDA批準(zhǔn)臨床使用，包括30個(gè)是治療腫瘤抗體。目前，治療性抗體市場主要集中應(yīng)用于腫瘤（～40%）、自身免疫性疾病（～25%）、遺傳疾�。ā�7%）、感染疾病（～6%）、心血管疾�。ā�4%）和血液疾�。ā�4%）等人相關(guān)疾病的治療。2018年數(shù)據(jù)表明，全球排名前十位最佳銷量藥物中有8個(gè)為抗體藥物，全球治療性抗體藥物市場價(jià)值接近1152億美元，預(yù)計(jì)到2019年底的銷量可達(dá)到1500億美元，到2025年預(yù)計(jì)可達(dá)3000億美元。

 

目前，就抗體藥物市場占有率而言，主要由7家生物醫(yī)藥企業(yè)主導(dǎo)，分別是Genentech (30.8%)、Abbvie （20.0%)、 Johnson & Johnson (13.6%)、Bristol-Myers Squibb (6.5%)、Merck Sharp & Dohme (5.6%)、Novartis (5.5%)、Amgen (4.9%),其他公司約占13%。

 

人源化抗體研發(fā)的成功，極大改善了抗體的臨床耐受性，為治療性抗體的廣泛臨床應(yīng)用打開了大門。目前已獲批的治療性抗體中，按抗體人源化程度方法分類，比如全人源抗體、人源化抗體、嵌合抗體和鼠源抗體，所占比例分別為51%、34.7%、12.5%和2.8%。

 

二、為什么要研發(fā)人源抗體？人源抗體研發(fā)技術(shù)與策略有哪些？

由于鼠源抗體臨床應(yīng)用具有諸多不利因素，比如會(huì)引起人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)，不僅加速了鼠源抗體的清除，也可引起難以預(yù)料的過敏反應(yīng)，而且，也限制了針對(duì)鼠源抗體Fc片斷反應(yīng)而誘發(fā)的抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC），嚴(yán)重阻礙鼠源抗體在臨床上的廣泛應(yīng)用。

 

為了降低鼠源抗體的免疫原性，嵌合抗體和人源抗體研發(fā)策略與技術(shù)隨之發(fā)展起來，也成為抗體藥物市場的重要抗體研發(fā)技術(shù)。噬菌體展示技術(shù)的建立，即由噬菌體表達(dá)人源抗體基因重組抗原結(jié)合片斷組合庫中，成功篩選獲得具有高親和力的第一個(gè)全人源抗體。同樣，通過構(gòu)建攜帶有人源抗體基因組小鼠模型，也成為目前研制人源抗體最具吸引力的技術(shù)平臺(tái)。另外，借助康復(fù)患者B淋巴細(xì)胞與人雜交瘤細(xì)胞相結(jié)合的技術(shù)，獲得針對(duì)特殊疾病的人源抗體，也成為一種人源抗體研發(fā)具有發(fā)展?jié)摿Φ男屡d技術(shù)。

 

建立人源化抗體首先是通過構(gòu)建嵌合抗體技術(shù)開始，即將鼠源抗體可變區(qū)與人源抗體恒定區(qū)相結(jié)合，嵌合抗體中約30%的序列來自小鼠，其余70%為人源抗體序列。該種嵌合抗體保留了抗體結(jié)合抗原的特異性。而相對(duì)于嵌合抗體技術(shù)，互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）移接技術(shù)，則只保留了鼠源抗體中結(jié)合抗原決定區(qū)序列，其余部分均為人源抗體成分，該種抗體中人源抗體序列占90%。因此，CDR移接技術(shù)較嵌合抗體的免疫原性更低，也曾被認(rèn)為是人源化抗體研發(fā)的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。該技術(shù)不僅使人抗嵌合抗體和人抗CDR抗體的發(fā)生率由約40% 降低至約9%水平，也為臨床上治療那些需要長期與反復(fù)治療的復(fù)雜疾�。ū热缒[瘤和自身免疫疾病）奠定了基礎(chǔ)。但是，人源化抗體技術(shù)的最大不足是缺乏通用的方法。比如，人源化的CDR移接過程個(gè)性化要求高。而且，由于10%鼠源抗體序列的存在，人源化抗體的臨床應(yīng)用仍含有一定程度免疫排斥或超敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

 

在人源化抗體研發(fā)技術(shù)成功的基礎(chǔ)上，90年代早期開始應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)研制全人源抗體。該技術(shù)是建立在構(gòu)建重組肽和蛋白平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)體外展示技術(shù)的基礎(chǔ)上。利用噬菌體包殼蛋白與外源多樣性組合抗體基因融合在一起，構(gòu)建所需的抗體組合表達(dá)庫，而這些與噬菌體外殼蛋白融合的人源抗體基因，可共同展現(xiàn)于噬菌體表面，再借助特異性抗原結(jié)合篩選方法，即可獲得與抗原特異結(jié)合的噬菌體抗體。應(yīng)用該技術(shù)平臺(tái)首先研發(fā)的人源抗體主要為抗體片斷（比如scFv和Fab）。在研制全人源抗體中，噬菌體展示技術(shù)的重要貢獻(xiàn)在于，該技術(shù)不依賴體內(nèi)免疫反應(yīng)，通過體外抗體篩選方法，直接獲得結(jié)合不同抗原（比如自身抗原、毒素、不穩(wěn)定和非免疫原性抗原等），且可供親和力成熟改造的候選人源抗體。

 

90年代初，研究者們也成功建立了另外一個(gè)全人源抗體研發(fā)技術(shù)平臺(tái)，即建立人源抗體基因小鼠模型，該技術(shù)是將人源抗體基因組導(dǎo)入或替換小鼠抗體相應(yīng)基因組，使小鼠的免疫系統(tǒng)經(jīng)抗原免疫后，可在小鼠體內(nèi)合成生產(chǎn)全人源抗體。人源抗體基因小鼠模型平臺(tái)的研制成功，無疑極大促進(jìn)了人源抗體臨床應(yīng)用的發(fā)展。

 

與噬菌體展示技術(shù)研制全人源抗體的“先快后慢”的特點(diǎn)相比，雖然在起初的抗原免疫小鼠、篩選特異性抗體及制備雜交瘤細(xì)胞等階段方面，人源抗體基因小鼠技術(shù)平臺(tái)相對(duì)較慢。但一旦獲得最初的抗體，由于隨后的抗體優(yōu)化過程是通過基因高頻突變?cè)谛∈篌w內(nèi)自然完成，因此，該技術(shù)平臺(tái)顯示出其在提高抗體親和力及有效性，以及不用擔(dān)心免疫排斥等方面的明顯優(yōu)勢。目前獲批的人源抗體臨床應(yīng)用也證明，在抗體藥物成藥性的相關(guān)指標(biāo)（比如抗體自我聚合、特異性結(jié)合等）評(píng)價(jià)方面，由人源抗體基因小鼠技術(shù)開發(fā)的抗體藥物都表現(xiàn)更好。

 

三、治療性抗體基本結(jié)構(gòu)與臨床疾病治療的相互關(guān)系？

目前已獲批上市的約80多種治療性抗體中，IgG是五種抗體免疫球蛋白(Ig) 分類中（IgA、 IgD、IgG、IgM和IgE ) 最常見的治療性抗體。IgG結(jié)構(gòu)為Y形的150kDa免疫球蛋白, 由兩對(duì)相同的重鏈和輕鏈，通過二硫鍵連接組成。Y形結(jié)構(gòu)的兩個(gè)臂分別構(gòu)成抗體的兩個(gè)抗原結(jié)合域 (Fab)， 包含抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)(Fv)。而抗體Y結(jié)構(gòu)中重鏈骨干區(qū)域稱之為片斷結(jié)晶區(qū)（Fc), 該區(qū)域具有IgG 抗體結(jié)合細(xì)胞表面Fc受體和補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白等作用，比如Fc伽馬受體 (FcγR)、補(bǔ)體蛋白（C1q)、新生FcR(FcRn)。

 

IgG抗體主要通過與其相應(yīng)“搭檔”的相互結(jié)合作用，而發(fā)揮其主要治療功能，比如抗原、補(bǔ)體、Fcγ受體和FcRn。其中抗體可變區(qū)與抗原的選擇性特異結(jié)合作用，是抗體發(fā)揮其治療功能的關(guān)鍵功能區(qū)。通過抗體Fc與其FcγR和補(bǔ)體蛋白結(jié)合，可引起Fc介導(dǎo)的抗體依賴細(xì)胞毒反應(yīng)（ADCC）和C1q介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒反應(yīng)（CDC），從而導(dǎo)致細(xì)胞破壞。而抗體Fc與其FcRn結(jié)合，則可能具有延長抗體循環(huán)半衰期的效果。

 

抗體的不同亞型能與不同的Fcγ受體相互作用，可顯著影響抗體的功能活性和藥物動(dòng)力學(xué)。比如，IgG1被認(rèn)為是治療性抗體的最適合亞型，占目前臨床上抗體的80.3%，而其他抗體亞型分別占IgG4(12.7%), IgG2(5.6%)和雜交IgG2/4(1.4%)。雖然，IgG3亞型在誘導(dǎo)ADCC和CDC方面最為重要，但目前仍無IgG3亞型抗體獲得批準(zhǔn)�？赡芘c該亞型抗體在體內(nèi)的半衰期較短，且抗體鉸鏈結(jié)構(gòu)較長，從而增加了生物加工過程的復(fù)雜性有關(guān)。IgG1、IgG2和IgG4抗體在血清中抗體半衰期都約為23天，而IgG3則只有2-6天。另外，IgG2抗體亞型不能結(jié)合Fcγ受體， 而IgG4卻不能激活補(bǔ)體系列反應(yīng)。

 

在獲批治療性抗體中，完整抗體約占78%， Fc融合蛋白為15%，抗體片斷約（Fab和scFv)為7%。 治療性抗體片斷的研發(fā)，在保留其特異性和選擇性基礎(chǔ)上，具有其研發(fā)時(shí)間與成本方面的優(yōu)勢，且也有針對(duì)腫瘤靶細(xì)胞與組織浸潤性較好的特點(diǎn)。但是，由于該類抗體缺少Fc區(qū)域，可影響其穩(wěn)定性，縮短其在體內(nèi)有效循環(huán)時(shí)間，從而影響其治療的效果。

 

相對(duì)于小分子藥物，大分子抗體藥物的特點(diǎn)是靶點(diǎn)特異性強(qiáng)，其毒性也多為靶點(diǎn)毒性，給藥方式多為兩周或一個(gè)月一次的靜脈或皮下注射，抗體藥物通過淋巴系統(tǒng)吸收，多分布于血管和腸道液體循環(huán)系統(tǒng)，并以蛋白酶水解方式代謝和通過抗體的FcRn受體回收。

哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是人源抗體生產(chǎn)的最為常見系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能大量生產(chǎn)，且有助于抗體生產(chǎn)過程中的翻譯后修飾，特別是對(duì)于需要糖基化的人源抗體而言。在已經(jīng)批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的治療性抗體中，有約63%是由中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞生產(chǎn)。其余有小鼠骨髓瘤細(xì)胞NSO（18%）和Sp2/0(11.1%),  人胚胎腎臟細(xì)胞系（HEK）293（4.2%）和大腸桿菌（4.2%）。

 

四、人源抗體基因小鼠模型建立有哪些策略與方法？目前這類人源抗體臨床應(yīng)用進(jìn)展如何？

利用小鼠模型研制人源抗體的策略，即應(yīng)用小鼠免疫系統(tǒng)，通過人源抗體基因在小鼠體內(nèi)重組和體細(xì)胞高突變的自然發(fā)生過程，生產(chǎn)針對(duì)不同免疫原的多樣性組合，且有特異性的人源抗體。人源抗體基因小鼠模型的建立，為治療性抗體研發(fā)提供了可靠的技術(shù)平臺(tái)。與其他人源抗體研制技術(shù)比較，基因小鼠技術(shù)平臺(tái)的優(yōu)勢表現(xiàn)有，人源抗體生產(chǎn)不僅無需人源化及更多抗體組合多樣性、且抗體體內(nèi)親和力成熟與篩選抗體克隆過程是自然優(yōu)化等。當(dāng)然，由于人源抗體Ig 基因覆蓋基因組區(qū)域非常大，也使構(gòu)建如此人源抗體基因小鼠有巨大的挑戰(zhàn)性。

 

1985年，科學(xué)家首先提出將人源抗體基因?qū)�入小鼠生殖�?xì)胞，通過建立轉(zhuǎn)基因小鼠來生產(chǎn)人源抗體的建議，該想法的提出開創(chuàng)了人源抗體生產(chǎn)研發(fā)的新思路。1989年，科學(xué)家們首次構(gòu)建了人源抗體重鏈基因載體，包括人源IgM抗體重鏈可變區(qū)（包括VDJ）和μ鏈恒定區(qū)基因。將約25kb大的質(zhì)粒DNA載體顯微注射至小鼠受精卵，成功獲得約4%小鼠B細(xì)胞表達(dá)人源抗體μ鏈，且能生產(chǎn)人源IgM抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。1993年，科學(xué)家們將小鼠抗體重鏈部分（JH）和輕鏈（Jk）基因敲除，并與表達(dá)人源IgH和IgL抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠交配，成功獲得能產(chǎn)生多樣性組合的人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠模型。

 

1994年，第一個(gè)人源抗體基因小鼠HuMabMouse技術(shù)平臺(tái)首先研制成功。該小鼠模型是在小鼠抗體重鏈和輕鏈（IgH和IgK)基因 敲除的基礎(chǔ)上，構(gòu)建能表達(dá)人源抗體重鏈和輕鏈基因。整個(gè)人源抗體重鏈基因組約有1.29Mb, 輕鏈基因組約為1.39Mb，而起初引入的人源抗體重鏈基因組只有約80kb大小。由于抗體多樣性組合是由其生殖細(xì)胞中V(D)J基因決定的，因此，如何增加導(dǎo)入人源抗體基因組容量，提高人源抗體基因組合的多樣性，則是成功研制該技術(shù)平臺(tái)的合理策略與需要解決的關(guān)鍵技術(shù)難題。

 

1993年，科學(xué)家們開始應(yīng)用酵母人工染色體（YAC）載體，通過酵母同源重組的方法，分別構(gòu)建人源抗體重鏈（～220kb) 和輕鏈（～300kb)載體，并借助酵母-胚胎干（ES）細(xì)胞融合方法，成功將其導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞。1997年，又將大片斷人源抗體重鏈（～1Mb)和輕鏈（～700kb)的YAC導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞，并與鼠源抗體基因（可變區(qū)和恒定區(qū)）敲除小鼠交配，成功構(gòu)建了表達(dá)人源抗體基因的XenoMouse小鼠模型。該基因小鼠包含了人源抗體重鏈可變區(qū)（VDJ）基因66個(gè)、輕鏈可變區(qū)（VJ）基因32個(gè)。雖然，XenoMouse和HuMabMouse小鼠模型都徹底排除了小鼠抗體基因可能對(duì)人源抗體基因的干擾影響，且也增加了人源抗體基因組合的多樣性，但由于這兩種小鼠抗體基因都被完全敲除，即小鼠不僅缺失抗體可變區(qū)基因，其恒定區(qū)基因也被敲除，從而降低了人源抗體生產(chǎn)的有效性，也影響了抗體在小鼠體內(nèi)的類別轉(zhuǎn)換效果和體細(xì)胞高頻突變發(fā)生率。

 

2014年，科學(xué)家們應(yīng)用細(xì)菌人工染色體（BAC）和Cre/loxP重組技術(shù)，在體外ES細(xì)胞系上，將人源抗體重鏈（V-D-J）可變區(qū)和輕鏈（Vk-Jk)可變區(qū)分別插入到小鼠重鏈恒定區(qū)（Cμ ）和輕鏈恒定區(qū)（Ck) 的上游區(qū)域，在不影響小鼠抗恒定區(qū)的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了KyMouse小鼠模型。KyMouse小鼠在抗原刺激后，能實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞高頻突變發(fā)生，并產(chǎn)生高親和力的人源抗體。

 

另外，科學(xué)家們通過構(gòu)建一定數(shù)量的大片斷人源抗體基因BAC，進(jìn)行系列顯微注射方法，將相應(yīng)BAC載體導(dǎo)入小鼠ES細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)人源抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因定點(diǎn)替換相應(yīng)小鼠抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，在保留小鼠抗體基因恒定區(qū)的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了Veloclmmune小鼠模型。

 

目前，應(yīng)用人源抗體基因小鼠技術(shù)平臺(tái)研制治療性抗體的生物醫(yī)藥企業(yè)主要有7家，包括，1. Cell Genesys/Abgenix公司研制的XenoMouse小鼠；2. Genpharm/Medarex公司的HuMAbMouse小鼠，該兩家公司后來分別被 Amgen于 2005年和Bristol Myers Squibb于2009收購；3. Kymab公司的KyMouse；4. Regeneron公司的VelociMouse小鼠；5. Harbour Biomed 公司的H2L2小鼠；6. Trianni 公司的Trianni小鼠；7. Ablexis公司的AlivaMab小鼠。然而，目前獲批的人源抗體也只是來自于XenoMouse、HuMAbMouse和VelociMouse三個(gè)基因小鼠技術(shù)平臺(tái)。

 

到目前為止，由HuMabMouse小鼠平臺(tái)研發(fā)并獲批的人源抗體已有8個(gè)，其中兩個(gè)抗體，抗CTLA-4抗體YervoyI和抗PD-1抗體 Opdivo，分別于2011年和2014年批準(zhǔn)，都是首先用于黑色素瘤患者治療�？笴TLA-4抗體能與免疫檢查點(diǎn)抑制因子CTLA-4結(jié)合，抑制CTLA-4與APC細(xì)胞表面的B7結(jié)合，激活細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞活性，實(shí)現(xiàn)殺死腫瘤細(xì)胞的作用。同樣，抗PD-1抗體與免疫檢查點(diǎn)抑制因子PD-1的結(jié)合，阻止其對(duì)腫瘤特異性T細(xì)胞的免疫抑制效果，達(dá)到腫瘤治療目的。HuMabMouse小鼠平臺(tái)獲批的兩個(gè)抗IL-12亞單位p40和IL-23抗體，能阻止促炎反應(yīng)信號(hào)作用，達(dá)到降低炎癥反應(yīng)的效果，用于臨床上治療自身免疫性疾病。此兩個(gè)抗體分別于2009年和2016年獲批治療嚴(yán)重斑塊狀牛皮癬和克羅恩氏回腸炎。

 

由XenoMouse小鼠平臺(tái)研發(fā)獲批人源抗體已有7個(gè)。2006年第一個(gè)全人源抗EGFR抗體, 用于治療EGFR表達(dá)（無KRAS基因突變）轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者。該人源抗體是阻止EGFR與其配體結(jié)合，抑制EGFR信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。另外有2個(gè)人源抗體用于治療自身免疫皮膚相關(guān)性疾�。黄渲幸粋�(gè)是人源抗IL-17抗體，具有降低牛皮癬患者的炎癥反應(yīng)作用。另外一個(gè)是人源抗IL-17受體抗體，發(fā)揮抑制IL-17家族細(xì)胞因子的作用。它們分別于2015年和2017年獲得美國FDA批準(zhǔn)，用于臨床治療牛皮癬患者。

 

作為第二代人源抗體基因Veloclmmune小鼠技術(shù)平臺(tái)，已獲得包括抗IL-4受體抗體、抑制IL-4和IL-13信號(hào)通路、以及抗IL-6受體抗體4個(gè)人源抗體藥物。2017年獲批的抗IL-6受體抗體，通過抑制IL-6信號(hào)通路，降低肝細(xì)胞釋放炎癥相關(guān)因子，實(shí)現(xiàn)治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病作用，并被認(rèn)為在治療新冠肺炎疾病中，該類抗體可能具有緩解由病毒引起的炎癥因子風(fēng)暴的作用。

 

五、人源抗體研發(fā)未來發(fā)展的趨勢？

治療性抗體研發(fā)領(lǐng)域這幾年發(fā)展非常迅速，已經(jīng)成為藥物研發(fā)市場的主力軍。然而，治療性抗體領(lǐng)域仍有巨大發(fā)展與應(yīng)用潛力。傳統(tǒng)意義上講，抗體藥物主要應(yīng)用于腫瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病等臨床治療。如果我們可以深入闡明某些特異蛋白或分子參與某些特殊疾病致病過程的分子機(jī)制，將有助于研發(fā)應(yīng)用范圍更廣、更加有效和特異性的治療性抗體。

 

治療性抗體研發(fā)未來發(fā)展趨勢可分為兩大種類型，第一類型為直接應(yīng)用于治療疾病的所謂裸抗體（naked antibady), 比如，治療腫瘤抗體，就是通過介導(dǎo)ADCC/CDC等相關(guān)通路，直接攻擊腫瘤細(xì)胞，引起細(xì)胞的凋亡，或者攻擊腫瘤細(xì)胞生長微環(huán)境，或攻擊免疫檢查點(diǎn)分子等。在此類抗腫瘤過程中，抗體是通過招募自然殺傷細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞，發(fā)揮消滅腫瘤細(xì)胞的作用。

 

第二類型抗體藥物是通過對(duì)抗體的進(jìn)一步加工修飾，達(dá)到增加其治療疾病價(jià)值的目的。通常應(yīng)用的抗體修飾方法與策略包括，抗體-免疫細(xì)胞因子結(jié)合、抗體-化學(xué)藥偶聯(lián)物、抗體-放射核素結(jié)合物、雙特異性抗體、免疫脂質(zhì)體、和嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）治療等�？贵w-免疫細(xì)胞因子結(jié)合，目的是通過抗體與特定細(xì)胞因子的融合，以增強(qiáng)細(xì)胞因子傳送的特異性。抗體-藥物偶聯(lián)物是由能特異性識(shí)別腫瘤靶點(diǎn)的抗體與小分子藥物相結(jié)合，從而增加了小分子藥物作用的特異性與有效性，降低了其對(duì)非靶點(diǎn)細(xì)胞的毒性作用�？贵w與放射核素的結(jié)合，也增加了放射療法特異性治療腫瘤作用。

 

最近，雙特異性抗體研發(fā)為抗體治療提供了具有巨大吸引力的新策略和新機(jī)會(huì)。雙特異性抗體是借助蛋白質(zhì)工程技術(shù)，將兩個(gè)抗原結(jié)合域（如Fabs/scFvs)相互連接起來，使一個(gè)抗體可同時(shí)識(shí)別兩個(gè)不同的抗原。因此，借助基因編輯技術(shù)方法，讓一個(gè)抗體發(fā)揮治療疾病的新功能，而不僅僅是原來兩個(gè)抗體簡單的混合體。多數(shù)雙特異性抗體的設(shè)計(jì)策略是基于結(jié)合免疫系統(tǒng)中，針對(duì)致病靶點(diǎn)的兩個(gè)細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞來設(shè)計(jì)的。目前，已有兩個(gè)雙特異性抗體進(jìn)入臨床應(yīng)用，一個(gè)是針對(duì)靶點(diǎn)CD3和CD19抗體，治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血�。ˋLL），另外一個(gè)是針對(duì)活化血凝因子IX和X的雙特異性IgG抗體，用于治療A型血友病。同時(shí)，有近85個(gè)雙特異性抗體進(jìn)入臨床試驗(yàn)，約86%為評(píng)價(jià)抗腫瘤治療效果的雙特異性抗體。

 

早期針對(duì)治療性抗體的研發(fā)集中在如何提高抗體結(jié)合、功能與藥物特征等更適合臨床應(yīng)用方面，比如，如何提高抗體可變區(qū)人源化程度及其親和力成熟，或者研制具有治療效果不同的抗體片斷（Fab和scFv) 等。隨后，這方面的研究開始轉(zhuǎn)向如何改善抗體的Fc功能，比如，如何提高抗體的ADCC、ADCP（抗體依賴細(xì)胞吞噬作用）、CDC、或滅活Fc功能等方面�？贵wFc工程成為增強(qiáng)抗體特異性活性和延長其有效期非常重要的工具，可實(shí)現(xiàn)降低抗體藥物使用量和潛在副作用的目的。

 

另外，嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞療法，則是另外一種抗體與T細(xì)胞相結(jié)合的技術(shù)應(yīng)用。通過將T細(xì)胞靶向特異性目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)破壞腫瘤細(xì)胞的目的。CAR-T細(xì)胞是將抗體可變區(qū)（比如scFv) 與T細(xì)胞的激活相關(guān)分子融合構(gòu)建而成。2017年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第一個(gè)CAR-T細(xì)胞治療藥物，用于臨床治療急性淋巴性白血�。ˋLL）以及成年大B細(xì)胞淋巴瘤。

 

從單個(gè)B細(xì)胞分離篩選研制人源抗體也是目前該研發(fā)領(lǐng)域的新趨勢，且有可能成為針對(duì)感染性疾病治療的新興研究領(lǐng)域。經(jīng)過EBV轉(zhuǎn)染單個(gè)B細(xì)胞永生化過程等方式研制人源抗體技術(shù)的優(yōu)勢，在于只需要少量人體外周血細(xì)胞，快速分離克隆潛在高效的人源抗體。面對(duì)新型病原致病因子的危險(xiǎn)，比如最近出現(xiàn)的新冠病毒感染疾病，快速研發(fā)具有免疫治療或多樣性組合抗體庫就更加具有其現(xiàn)實(shí)意義。而單個(gè)B細(xì)胞分選技術(shù)則是實(shí)現(xiàn)該研發(fā)目的最為理想的選擇。雖然，目前應(yīng)用單個(gè)B細(xì)胞方法已成功研制出抗病毒的人源抗體。比如，抗登革熱病毒、抗Zika病毒、抗Ebola病毒、抗HIV病毒和抗呼吸道合胞病毒（RSV）的人源抗體。其中許多此類人源抗體目前分別進(jìn)入不同階段（I/II/III期）的臨床試驗(yàn)。

 

然而，目前為止，還沒有FDA批準(zhǔn)的由單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)研發(fā)的人源抗體進(jìn)入臨床應(yīng)用，該技術(shù)仍面臨需要克服相關(guān)問題的挑戰(zhàn)。比如抗原標(biāo)記技術(shù)、分選抗原配置、以及克隆抗體引物設(shè)計(jì)等。結(jié)合新一代NGS測序技術(shù)，新診斷、藥物代謝動(dòng)力學(xué)應(yīng)用和臨床治療方面的進(jìn)展，單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)研制人源抗體也將成為一個(gè)非常有力的工具，實(shí)現(xiàn)尋找與發(fā)現(xiàn)具有稀有特征的治療性抗體，以滿足未來新一代治療性抗體研發(fā)的設(shè)計(jì)需求與目標(biāo)。

 

近年來，臨床上應(yīng)用多個(gè)抗體組合的策略（抗體雞尾酒療法）治療疾病，也被認(rèn)為是抗體治療某些特殊疾病的發(fā)展方向。此種所謂的抗體雞尾酒療法，起初主要基于是針對(duì)腫瘤或感染性疾病中，同一靶點(diǎn)的不同抗原表位的策略。該種療法有利于潛在降低抗體使用量的同時(shí)，增加多個(gè)抗體協(xié)同作用，達(dá)到提高治療疾病有效性和安全性的目的。所以，抗體雞尾酒療法的開發(fā)，既發(fā)揮了各個(gè)抗體的特異性、質(zhì)量可控、副作用低等優(yōu)點(diǎn)，又兼顧了多抗結(jié)合位點(diǎn)多、親合力強(qiáng)、逃逸可能性低等長處，成為人源抗體藥物研制的有利補(bǔ)充。

 

另外，在已成功建立人源抗體基因小鼠技術(shù)平臺(tái)基礎(chǔ)上，對(duì)其他非傳統(tǒng)的人源抗體基因小鼠技術(shù)平臺(tái)也受到人們一定的關(guān)注，比如，有利用于多特異性人源抗體研發(fā)的技術(shù)平臺(tái)，包括只含重鏈的 HCAb (Harbour BioMed)或只含輕鏈（OmniFlic) 的人源抗體基因小鼠模型，以及建立其他類似的基因動(dòng)物模型，比如，人源抗體基因大鼠模型（OmniRat®）、人源抗體基因雞模型（OmniChicken™）和人源抗體基因牛模型（Tc Bovine™）等相應(yīng)技術(shù)平臺(tái)。

 

六、抗新冠病毒人源抗體研發(fā)目前有哪些進(jìn)展？

針對(duì)當(dāng)前面臨的新冠肺炎全球大流行的挑戰(zhàn)，全球科學(xué)家們也正在應(yīng)用單個(gè)B細(xì)胞分離篩選與人源抗體基因小鼠等技術(shù)平臺(tái)，加速研制針對(duì)新冠病毒的人源中和抗體，希望早日成功應(yīng)用于抗新冠肺炎治療。比如，Eli Lilly公司研發(fā)的抗新冠病毒中和抗體（LY-CoV555）是全球首個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的抗新冠病毒抗體藥物。國內(nèi)的君實(shí)生物研制的抗新冠病毒抗體（JS016）也宣布進(jìn)入臨床試驗(yàn)。Eli Lilly和君實(shí)生物研發(fā)的抗新冠病毒中和抗體都是來自新冠肺炎康復(fù)患者外周血分離的單個(gè)B細(xì)胞。

 

另外，中國科學(xué)院微生物研究所為主導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)最近報(bào)道，從新冠肺炎康復(fù)患者體內(nèi)分離鑒定到的幾十株全人源抗體基因，最終篩選獲得兩株理想的特效抗體，具有高效中和新冠病毒的活性。恒河猴新冠病毒感染模型研究證實(shí)，該兩株人源抗體能有效地阻斷新冠病毒的感染，顯著降低了恒河猴呼吸道中新冠病毒的載量，保護(hù)由病毒感染造成的肺部損傷。目前該人源抗體也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

 

考慮到新冠病毒已發(fā)生突變及抗體藥物臨床使用潛在逃逸風(fēng)險(xiǎn)的因素，國內(nèi)外不少研究團(tuán)隊(duì)將抗體雞尾酒療法放在了新冠病毒中和抗體藥物研發(fā)的首位。再生元（Regeneron）公司應(yīng)用其VelocImmune人源抗體基因小鼠平臺(tái)，結(jié)合康復(fù)患者外周血分離的單個(gè)B細(xì)胞分離技術(shù)，開發(fā)了兩個(gè)中和活性高，且無競爭的抗新冠病毒抗體。臨床前研究表明，由此兩種人源抗體組合的抗體雞尾酒療法，具有中和目前已知的新冠病毒突變毒株的作用。由于該兩種抗新冠病毒抗體與刺突蛋白S的受體結(jié)合域（RBD）結(jié)合為非競爭性，從而可降低突變病毒逃逸抗體治療的幾率。該抗體雞尾酒療法最近進(jìn)入臨床試驗(yàn)III期。

 

和鉑醫(yī)藥（Harbour BioMed）也是最早研制抗新冠病毒感染抗體的公司之一。應(yīng)用其H2L2全人源抗體基因小鼠技術(shù)平臺(tái)，篩選出一株有效抵抗新冠病毒感染的人源抗體。由于該抗體靶向新冠病毒和SARS病毒共用的保守表位，因此，該抗體有望對(duì)同亞屬的冠狀病毒同時(shí)發(fā)揮預(yù)防和治療的作用。研究者認(rèn)為，由于這款抗體對(duì)病毒的中和能力并不依賴于抑制新冠病毒RBD與ACE2受體的結(jié)合，所以，該抗體有望和其他針對(duì)新冠病毒受體結(jié)合的抗體組合應(yīng)用形成“雞尾酒療法”，產(chǎn)生協(xié)同抗新冠病毒感染的作用。

 

目前，根據(jù)全球新冠抗體藥物數(shù)據(jù)庫資料表明，有超過百種的抗體藥物療法，其中傳統(tǒng)抗體形式占到約81%，其他為各種形式抗體藥物（比如單域抗體、融合抗體和單克隆抗體等）及相關(guān)藥物，覆蓋了抗新冠肺炎從早期感染到全身性器官衰竭（比如包括抗細(xì)胞因子風(fēng)暴反應(yīng)的抗體IL-6R、GM-CSF和C5等）靶點(diǎn)相關(guān)抗體藥物。新冠病毒刺突S蛋白則是研發(fā)相應(yīng)中和抗體最受關(guān)注的靶點(diǎn)，而目前針對(duì)抗新冠肺炎治療性抗體研發(fā)的技術(shù)策略，則是以單個(gè)B細(xì)胞分離篩選技術(shù)為主，以及應(yīng)用人源抗體基因小鼠模型和噬菌體展示等技術(shù)平臺(tái)。現(xiàn)在絕大部分相關(guān)抗體藥物的研發(fā)仍處于臨床前，有接近20%的抗體藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

 

人源抗體研制已顯示了其作為神奇子彈的高效性與特異性，雖然在實(shí)際臨床應(yīng)用中，仍難以避免一些副反應(yīng)的發(fā)生。比如，從短暫的抗藥物抗體（ADA）的出現(xiàn)，到嚴(yán)重的癱瘓和藥物清除障礙等。相信隨著抗體研制新技術(shù)與策略的不斷發(fā)展與完善，將會(huì)促進(jìn)人源抗體研發(fā)，擴(kuò)大抗體藥物治療多種人相關(guān)疾病的范圍，讓更多不同疾病患者受益。

 

作者簡介

作者

俞曉峰 博士，高級(jí)科學(xué)家

 

俞曉峰博士現(xiàn)任賽業(yè)模式生物副總裁、高級(jí)科學(xué)家，負(fù)責(zé)基因修飾模式動(dòng)物的研發(fā)與技術(shù)服務(wù)等工作。俞博士在遺傳基因模式動(dòng)物領(lǐng)域有超過20年研發(fā)與管理等方面的豐富經(jīng)驗(yàn)，在干細(xì)胞相關(guān)領(lǐng)域及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發(fā)表在Nature Immunology，Hum Mol Genet，Mol Cell Biol 等高水平雜志上。加入賽業(yè)生物前，俞博士2010-2013年任職于美國應(yīng)用干細(xì)胞（ASC）公司，擔(dān)任研發(fā)總監(jiān)，負(fù)責(zé)基因修飾模式動(dòng)物的研發(fā)與定制服務(wù)，并在中國子公司斯坦福生物科技擔(dān)任副總裁一職。2009-2010任紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員。2003-2009期間任職于美國基因打靶公司（iTL），作為資深科學(xué)家和項(xiàng)目經(jīng)理負(fù)責(zé)參與了基因修飾小鼠模型研發(fā)方案與策略設(shè)計(jì)、項(xiàng)目管理、技術(shù)人員指導(dǎo)與培訓(xùn)、以及客戶服務(wù)和技術(shù)咨詢等方面工作，2007年起負(fù)責(zé)開發(fā)了p53基因不同點(diǎn)突變的人源化腫瘤小鼠模型庫項(xiàng)目。2000年任美國耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員。1995年獲得軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位。