陽離子脂質(zhì)材料DOTMA和DOPE在脂質(zhì)體轉染實驗的應用
本期AVT小編給大家分享一下DOTMA和DOPE在脂質(zhì)體轉染實驗中的應用，在前段時間，AVT產(chǎn)品庫新添了幾款新型注射級陽離子脂質(zhì)材料，包括DLin-MC3-DMA、DMG-PEG2000，DOTMA等，感興趣的小伙伴可以去我們的產(chǎn)品圖一睹究竟，讓我們接著往下看脂質(zhì)體轉染的那些事！
脂質(zhì)體轉染實驗步驟
脂質(zhì)體(LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前條件下最方面的轉染方法之轉染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進行轉染時，首先需要優(yōu)化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h,開始按這兩個參數(shù)繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉染時間，因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24h為宜。
細胞種類：C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。
1、操作步驟(方法一)：
取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2m1含(1-2)x105個細胞的培養(yǎng)基，37℃、18%C02培養(yǎng)基40%-60%匯合時。
2)轉染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉染1個空細胞所用的A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug,終量100u1。B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min,稍后會岀現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉染
3)轉染準備：用2m1不含血清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入1m1不含血清培養(yǎng)基
4)轉染：把AB復合物緩緩加入培養(yǎng)基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h吸除無血清轉染液，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)
5)其余處理：如觀察、篩選、檢測等與其他轉染法相同
6)注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。
2、快速脂質(zhì)體轉染法操作步驟(方法二)
●……將細胞以5x105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h,使其達到50%-60%板底面積。
●……在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復合物
a、在1m1無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNAb、旋轉1s,再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉。
c、室溫下放置5-10min,使DNA結合在脂質(zhì)體上。
●……棄去細胞中的舊液，用1m1無血清DMEM洗細胞1次后棄去，向每孔中直接加入1m1DNA-脂質(zhì)體復合物，37℃培養(yǎng)3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)14-24h。吸出DEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培養(yǎng)24-48h。用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定
3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉染法：
●……接種細胞同前述，細胞長至50%
●……DNA-脂質(zhì)體復合物制備轉染細胞同前。
●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培養(yǎng)48h。
●……吸出DEM,用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細胞，使細胞生長一定時間篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行。
細胞轉染技術總述
一、細胞轉染途徑
轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于物理介導技術；化學介導方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀；
脂質(zhì)體轉染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導的技術；生物介導方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉染技術
1、物理介導
1）電穿孔法：靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞
優(yōu)點：轉染效率較高
缺點：需要昂貴的儀器(電穿孔儀)；對細胞的損傷較大，每次轉染需要
更多的細胞和DNA;每種細胞電轉的條件都需要進行多次優(yōu)化
2)顯微注射：借助顯微注射器直接把DNA注入核內(nèi)，使之整合入受體細胞基因組中
優(yōu)點：轉染效率高，可用于瞬時轉染和穩(wěn)定轉染
缺點：導入DNA時需要一個細胞一個細胞注射，不適合大量轉染
3)基因槍：依賴攜帶了核酸的高速粒子將核酸導入細胞內(nèi)2、化學介導
2、化學介導
(1)磷酸鈣共沉淀法
磷酸鈣有利于促進外源DNA與靶細胞表面結合，氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按定的比例混和，形成極小的磷酸鈣-DNA復合物沉淀黏附在細胞膜表面，借助內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對于轉染的成功至關重要。
優(yōu)點:能用于任何DNA導入哺乳類動物，瞬時轉染和穩(wěn)定轉染。
缺點:轉染效率低:進入細胞的DNA只有1 %- 5 %可以進入細胞核，其中只有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合,在細胞中進行穩(wěn)定表達。重復性不佳:pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應時間、細胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結果產(chǎn)生影響。
(2)脂質(zhì)體轉染法
中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導入細胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體，DNA 并沒有預先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的 DNA自動結合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被導入細胞。
優(yōu)點:適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞，可用于瞬時轉染和穩(wěn)定轉染;轉染效率高，比磷酸鈣法高5-100倍;能夠把DN A和R N A轉染到各種細胞，轉染的穩(wěn)定性好，可重復性高，轉染時最好不加血清和抗生素。
缺點:陽離子脂質(zhì)體細胞毒性相對較高，對部分細胞可能會干擾細胞的代謝。
(3)多種陽離子物質(zhì)介導
DEAE-葡聚糖介導的轉染，其原理還不清楚，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉導進入細胞核，此法只適合暫時轉染實驗，轉染效率與DEAE-葡 聚糖濃度以及細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關系，可采用較高濃度的細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時間(30 分鐘-1.5小時),也可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長時間(8小時)。
3、生物介導
病毒介導的轉染:以病毒作為載體,通過病毒感染的方式將外源DNA導入到細胞中，其中以逆轉錄病毒及腺病毒轉染系統(tǒng)最為常用。
優(yōu)點:整和效率高，可使外源基因在宿主細胞中長期表達，適用于難以轉染的原代細胞。
缺點:存在潛在的安全危險性。
二、理想的細胞轉染方法
理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小、重復性好、安全、簡單等優(yōu)點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，病毒轉染方法的準備程序復雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點。
三細胞轉染分類
瞬時轉染:是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體.上，不整合到細胞的染色體上。
穩(wěn)定轉染: DNA 整合到宿主細胞的染色體中。
四、報告基因
是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控。
常用的報告基因系統(tǒng):半乳糖苷酶報告系統(tǒng)、素酶報告系統(tǒng)、蛋白報告系統(tǒng)(GFP)等。
五、轉染方法
本人用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉染單層貼壁細胞。( 別的方法可以參考生產(chǎn)商提供的protocol)
1、轉染前1天將0.5~2X105細胞接種于24孔培養(yǎng)板，并加入500ul不含抗生素的完全培養(yǎng)基，以保證轉染時細胞匯合達90~95%。
2、準備復合物
(1)將0.8ugDNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。
(2)將 2ul Lipofectamine2000 稀釋于50u1無血清無抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕渾勻，室溫孵育5分。注意:必須在25分內(nèi)進行。
(3) 5 分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。
3、吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，用PBS或無血清培養(yǎng)基(最好)清洗細胞2次。4、將復合物(總體積100u1)加入培養(yǎng)孔，前后搖動培養(yǎng)板使其分布均勻。.
5、將細胞放入培養(yǎng)箱孵育4~6h后，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復合物(也可不用)。
6、24~ 48h后可以觀察轉入基因表達情況。
7、穩(wěn)定轉染:換含血清培養(yǎng)基24h后將細胞以1: 10 (或更高比例)傳代，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選。
8、優(yōu)化:要保證細胞匯合率達90~95% (比較高) ; DNA/ Lipofectamine2000比率1: 0.5~1: 5，一般細胞1: 2~3.
本文文章來源：百度文庫《脂質(zhì)體轉染實驗步驟脂質(zhì)體(LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DOPE》作者：淘氣的小孩00
脂質(zhì)體轉染實驗步驟
脂質(zhì)體(LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前條件下最方面的轉染方法之轉染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。用LR進行轉染時，首先需要優(yōu)化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h,開始按這兩個參數(shù)繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉染時間，因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24h為宜。
細胞種類：C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。
1、操作步驟(方法一)：
取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2m1含(1-2)x105個細胞的培養(yǎng)基，37℃、18%C02培養(yǎng)基40%-60%匯合時。
2)轉染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉染1個空細胞所用的A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug,終量100u1。B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min,稍后會岀現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉染
3)轉染準備：用2m1不含血清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入1m1不含血清培養(yǎng)基
4)轉染：把AB復合物緩緩加入培養(yǎng)基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h吸除無血清轉染液，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)
5)其余處理：如觀察、篩選、檢測等與其他轉染法相同
6)注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。
2、快速脂質(zhì)體轉染法操作步驟(方法二)
●……將細胞以5x105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h,使其達到50%-60%板底面積。
●……在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復合物
a、在1m1無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNAb、旋轉1s,再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉。
c、室溫下放置5-10min,使DNA結合在脂質(zhì)體上。
●……棄去細胞中的舊液，用1m1無血清DMEM洗細胞1次后棄去，向每孔中直接加入1m1DNA-脂質(zhì)體復合物，37℃培養(yǎng)3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)14-24h。吸出DEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培養(yǎng)24-48h。用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定
3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉染法：
●……接種細胞同前述，細胞長至50%
●……DNA-脂質(zhì)體復合物制備轉染細胞同前。
●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培養(yǎng)48h。
●……吸出DEM,用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細胞，使細胞生長一定時間篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行。
細胞轉染技術總述
一、細胞轉染途徑
轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于物理介導技術；化學介導方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀；
脂質(zhì)體轉染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導的技術；生物介導方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉染技術
1、物理介導
1）電穿孔法：靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞
優(yōu)點：轉染效率較高
缺點：需要昂貴的儀器(電穿孔儀)；對細胞的損傷較大，每次轉染需要
更多的細胞和DNA;每種細胞電轉的條件都需要進行多次優(yōu)化
2)顯微注射：借助顯微注射器直接把DNA注入核內(nèi)，使之整合入受體細胞基因組中
優(yōu)點：轉染效率高，可用于瞬時轉染和穩(wěn)定轉染
缺點：導入DNA時需要一個細胞一個細胞注射，不適合大量轉染
3)基因槍：依賴攜帶了核酸的高速粒子將核酸導入細胞內(nèi)2、化學介導
2、化學介導
(1)磷酸鈣共沉淀法
磷酸鈣有利于促進外源DNA與靶細胞表面結合，氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按定的比例混和，形成極小的磷酸鈣-DNA復合物沉淀黏附在細胞膜表面，借助內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對于轉染的成功至關重要。
優(yōu)點:能用于任何DNA導入哺乳類動物，瞬時轉染和穩(wěn)定轉染。
缺點:轉染效率低:進入細胞的DNA只有1 %- 5 %可以進入細胞核，其中只有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合,在細胞中進行穩(wěn)定表達。重復性不佳:pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應時間、細胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結果產(chǎn)生影響。
(2)脂質(zhì)體轉染法
中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導入細胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體，DNA 并沒有預先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的 DNA自動結合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被導入細胞。
優(yōu)點:適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞，可用于瞬時轉染和穩(wěn)定轉染;轉染效率高，比磷酸鈣法高5-100倍;能夠把DN A和R N A轉染到各種細胞，轉染的穩(wěn)定性好，可重復性高，轉染時最好不加血清和抗生素。
缺點:陽離子脂質(zhì)體細胞毒性相對較高，對部分細胞可能會干擾細胞的代謝。
(3)多種陽離子物質(zhì)介導
DEAE-葡聚糖介導的轉染，其原理還不清楚，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉導進入細胞核，此法只適合暫時轉染實驗，轉染效率與DEAE-葡 聚糖濃度以及細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關系，可采用較高濃度的細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時間(30 分鐘-1.5小時),也可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長時間(8小時)。
3、生物介導
病毒介導的轉染:以病毒作為載體,通過病毒感染的方式將外源DNA導入到細胞中，其中以逆轉錄病毒及腺病毒轉染系統(tǒng)最為常用。
優(yōu)點:整和效率高，可使外源基因在宿主細胞中長期表達，適用于難以轉染的原代細胞。
缺點:存在潛在的安全危險性。
二、理想的細胞轉染方法
理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小、重復性好、安全、簡單等優(yōu)點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，病毒轉染方法的準備程序復雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點。
三細胞轉染分類
瞬時轉染:是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體.上，不整合到細胞的染色體上。
穩(wěn)定轉染: DNA 整合到宿主細胞的染色體中。
四、報告基因
是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控。
常用的報告基因系統(tǒng):半乳糖苷酶報告系統(tǒng)、素酶報告系統(tǒng)、蛋白報告系統(tǒng)(GFP)等。
五、轉染方法
本人用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉染單層貼壁細胞。( 別的方法可以參考生產(chǎn)商提供的protocol)
1、轉染前1天將0.5~2X105細胞接種于24孔培養(yǎng)板，并加入500ul不含抗生素的完全培養(yǎng)基，以保證轉染時細胞匯合達90~95%。
2、準備復合物
(1)將0.8ugDNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。
(2)將 2ul Lipofectamine2000 稀釋于50u1無血清無抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕渾勻，室溫孵育5分。注意:必須在25分內(nèi)進行。
(3) 5 分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。
3、吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，用PBS或無血清培養(yǎng)基(最好)清洗細胞2次。4、將復合物(總體積100u1)加入培養(yǎng)孔，前后搖動培養(yǎng)板使其分布均勻。.
5、將細胞放入培養(yǎng)箱孵育4~6h后，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復合物(也可不用)。
6、24~ 48h后可以觀察轉入基因表達情況。
7、穩(wěn)定轉染:換含血清培養(yǎng)基24h后將細胞以1: 10 (或更高比例)傳代，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選。
8、優(yōu)化:要保證細胞匯合率達90~95% (比較高) ; DNA/ Lipofectamine2000比率1: 0.5~1: 5，一般細胞1: 2~3.
本文文章來源：百度文庫《脂質(zhì)體轉染實驗步驟脂質(zhì)體(LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DOPE》作者：淘氣的小孩00
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com