轉(zhuǎn)基因大鼠在突破技術(shù)限制再次發(fā)揮在特定領(lǐng)域研究的應(yīng)用

 

建立合適的疾病動物模型是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科研中非常重要的研究方法，大鼠和小鼠是疾病研究中的主力軍。由于體積小、成本低，特別是胚胎細胞相對穩(wěn)定，方便進行各種遺傳操作，進行基因編輯這個優(yōu)點，使得小鼠成為解析人類基因功能最重要的模式生物。但是，與小鼠相比，大鼠在生理特征、形態(tài)和基因上更加接近人類，同時大鼠較大的身體和器官尺寸便于多次采樣，以及進行體內(nèi)電生理學(xué)、神經(jīng)外科和神經(jīng)影像學(xué)程序操作，因此，相對小鼠來說，大鼠更合適用于毒理學(xué)、畸形學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)病學(xué)、實驗老年學(xué)、心血管、牙科和實驗寄生蟲學(xué)等領(lǐng)域的研究。接下來我們將重點探討大鼠與小鼠有哪些差異？這些差異使得在哪些研究領(lǐng)域更適合選擇大鼠？如何最大化地發(fā)揮大鼠的優(yōu)勢進行研究？

 

大鼠與小鼠主要有哪些差異？

首先是在與人類的相似性方面，雖然大鼠小鼠和人類進化的差異區(qū)別很小。但大鼠某些方面與人類更為接近，比如小鼠的心率可以達到600 bpm，而大鼠則降低到了300 bpm左右，與人類的70 bpm更為接近�；�因組上看，小鼠為26億對，大鼠27.5億對，與人類的29億對更為接近。染色體方面，小鼠20對，大鼠和人類分別是21和23對。

 

SD大鼠和C57小鼠是生物醫(yī)學(xué)研究中（尤其是神經(jīng)生物學(xué)研究）中最常用的大鼠和小鼠代表，最近的研究通過基于基因芯片分析發(fā)現(xiàn)在檢測到的10,833個基因中，有4713個基因在大鼠和小鼠的海馬神經(jīng)元樹突中存在表達差異。而同樣也是采用基因芯片技術(shù)研究海馬神經(jīng)元，只有54個基因在C57BL/6和BALB/c兩個最常用的小鼠品系之間有差異表達。考慮到海馬體在行為(尤其是學(xué)習(xí)記憶)中的重要性，這一發(fā)現(xiàn)很好地解釋了大小鼠行為方面的不同。同樣地，研究人員還比較了大鼠和小鼠的其他組織(包括心臟、骨骼肌、腸子等)，盡管這些組織的差異也很大，但它們遠沒有海馬體中的差異那么明顯。不過這也足夠提醒我們要注意大小鼠之間實驗結(jié)果的差異。大鼠和小鼠之間最明顯的區(qū)別之一是在大小和體重上，成年大鼠的體重大約是成年小鼠的8到10倍，體型方面對科研造成的影響則是有利有弊。

 

哪些研究領(lǐng)域更適合選擇大鼠？

1）大鼠是研究心血管疾病極好的模型，尤其是中風(fēng)和高血壓，而且有多種品系的大鼠模型已經(jīng)成為這些研究的理想對象。

2）大鼠乳腺癌模型優(yōu)于小鼠模型，因為它們對組織病理學(xué)有激素反應(yīng)，并且具有更接近人類疾病的癌前階段。

3）大鼠是人類生殖力學(xué)研究的主要模型。

4）在糖尿病模型中，大鼠模型在一些重要的方面與人類更為接近，包括環(huán)境因素(如毒素、壓力、飲食和疫苗接種)改變疾病的能力。

5）經(jīng)退行性疾病方面，Pink1和DJ-1敲除的大鼠在8月齡時表現(xiàn)出中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元50%以上的丟失，相比于小鼠表型的不明顯，大鼠基因編輯模型給了我們更多治療帕金森病的希望。這也是第一次在基因編輯動物模型中發(fā)現(xiàn)多巴胺神經(jīng)元的丟失。同時這些大鼠也在檢測運動神經(jīng)元功能的行為學(xué)實驗中出現(xiàn)了癥狀。

6）小鼠在行為學(xué)上的一致性比較差，通常需要每組數(shù)量在大鼠的1.5倍時統(tǒng)計所得的結(jié)果才相對可靠。大鼠比小鼠更聰明，在學(xué)習(xí)記憶實驗中具有更好的表現(xiàn)，因此藥物對它們的影響也更為明顯。在疼痛研究方面，大鼠不容易出現(xiàn)小鼠中常見的焦慮引起的痛覺麻木，事實上，痛覺相關(guān)的文獻數(shù)量上大鼠從來沒有被小鼠打敗過。

7）過去的臨床前研究在小鼠實驗中驗證了藥物的有效性之后，還需要在大鼠身上對安全性進行驗證，才能進行臨床的人體安全性試驗，這是因為大鼠的安全性數(shù)據(jù)在歷史上積累豐富，參考性很強。在大鼠基因編輯成熟之后，人們便可以在大鼠身上直接和同時進行有效性和安全性的檢測，節(jié)省了時間。

8）大鼠的大體型提供了許多實際的優(yōu)勢，特別是在外科手術(shù)和脊髓損傷的研究中，大鼠模型在這方面具有很大的轉(zhuǎn)化價值。同時在器官組織成像研究中也比小鼠更有優(yōu)勢。

 

近年來在醫(yī)療科研領(lǐng)域，從臨床前向臨床轉(zhuǎn)化的過程中，大量基于小鼠的研究以失敗而告終，這讓人們不得不靜下心來思考是否我們還是需要與這些人類疾病更相關(guān)的動物模型，在這個背景之下，科學(xué)家們又將目光重新投向了大鼠，因為比起開發(fā)新的模式動物所需投入的巨大時間和資金投入，大鼠算是人們的了“老朋友”了，而且大鼠在基因編輯時代的潛力還遠未得到充分開發(fā)。

 

如何最大化地發(fā)揮大鼠的優(yōu)勢進行研究？

隨著人們對大鼠胚胎控制能力的增強以及CRISPR/Cas9技術(shù)的到來，拓展了大鼠做為實驗?zāi)Ｊ絼游镌诨�礎(chǔ)研究及藥物篩選、臨床前藥物評價的應(yīng)用范圍。但是，作為最重要的基因條件性表達方案，Cre-LoxP系統(tǒng)中大鼠品種相對小鼠種類上要少了很多，這一點嚴重阻礙了我們對大鼠的應(yīng)用。Cre-LoxP系統(tǒng)在小鼠中的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)廣泛了，很多基因都有對應(yīng)的LoxP小鼠存在，同時特異性啟動子的Cre小鼠資源也相當(dāng)豐富。但是在大鼠中，由于基因編輯技術(shù)發(fā)展的落后，目前無論是LoxP大鼠還是連接了組織特異性啟動子的Cre大鼠，它們的種類都要遠低于小鼠。賽業(yè)生物針對超排大鼠胚胎受精比例低而畸形胚胎比例高，卵細胞品系和個體間差異大，核膜和質(zhì)膜更厚更有彈性導(dǎo)致更難注射等多項難點，不斷優(yōu)化生產(chǎn)過程各個環(huán)節(jié)，攻克多項技術(shù)難關(guān)，可實現(xiàn)更復(fù)雜的條件性基因敲除大鼠模型創(chuàng)建。賽業(yè)生物可為您提供基因敲除、點突變、基因敲入等多種基因編輯大鼠服務(wù)，還可為您提供SD、Wistar、Long Evans、F344、Brown Norway大鼠等多種品系選擇，致力于為您構(gòu)建更好的大鼠模型。賽業(yè)生物正在著手建立一個Cre模型庫，其中包含各種大小鼠品系，以供全球研究人員使用。

 

 備注：除以上列出的Cre大鼠模型外，如您需要其他品系的大鼠模型，可撥打400-680-8038聯(lián)系我們，以獲取專屬的定制服務(wù)報價。

考慮到Cre大鼠需要與LoxP大鼠雜交一至兩代才能得到條件性基因編輯動物，同時Cre酶也存在效率和一定概率的泄露問題，可能會對科研進度產(chǎn)生影響，病毒誘導(dǎo)的大鼠基因過表達/敲除/敲入/點突變便應(yīng)運而生。

 

目前主要使用的病毒表達系統(tǒng)有三種，即腺病毒（Adeno）、慢病毒和腺相關(guān)病毒表達系統(tǒng)，這些病毒系統(tǒng)各有優(yōu)缺點：

1）腺病毒的優(yōu)點是表達效率高，表達起始時間早，可包裝DNA片段相對最大，但有很強的免疫原性和毒性，一般適用于離體細胞轉(zhuǎn)染，用在活體上的話動物死亡率高，實驗窗口期短。

 

2）慢病毒則可以逆轉(zhuǎn)錄成DNA，并永久整合到宿主基因中，因此目的基因可以長期穩(wěn)定表達，慢病毒是最常用的基因傳遞病毒系統(tǒng)，并且具有比腺病毒小得多的免疫原性。雖然也可以用作活體轉(zhuǎn)染，但是在滴度，效率和免疫原性都更好的腺相關(guān)病毒面有些“相形見絀”。

 

3）腺相關(guān)病毒的最大優(yōu)勢在于極低的免疫原性可以在最大可能地保證自己能與宿主長期共存。生物安全性也很高，可以在生物安全等級較低的實驗室中進行實驗，種類繁多的血清型使得其對不同組織的親和度有區(qū)別，使得即便在全身注射的情況下仍然具有很強的組織特異性，輔以定位注射的話，可以大大提高實驗的組織細胞精度，是最適合活體實驗的工具病毒，但也存在克隆容量不足的問題。

 

圖1. 三種常見病毒載體比較

 

綜合三種工具病毒的優(yōu)缺點來看，在與Cre或者LoxP動物聯(lián)用方面，AAV介導(dǎo)的組織特異性表達具有相對于另外兩種病毒系統(tǒng)更好的效果。

 

圖2.不同AAV的組織特異性

 

正因為AAV的這些優(yōu)點，得以使其在與Cre或者LoxP大鼠鼠的配合中大放異彩。這是因為雖然人們正在開發(fā)更多的LoxP和Cre大鼠，但這個過程并非一蹴而就。考慮到大鼠中Cre酶的效率和有可能存在的泄露問題，可能導(dǎo)致開發(fā)時間會變得更長。因此，目前最佳策略是在開發(fā)Cre和LoxP大鼠的同時，利用AAV病毒先行對已有大鼠進行組織特異性操作。病毒載體的構(gòu)建總是要比動物繁殖到可用于實驗的數(shù)量所需時間要少得多。因此可以通過這種方法盡快對動物的表型進行研究和驗證，盡早決定下一步的研究策略和方向，節(jié)省科研人員寶貴的時間。

 

需要注意的是，AAV注射所產(chǎn)生的特異性表達并非僅僅只是節(jié)省時間的“權(quán)宜之計”。由于生命科學(xué)研究中體內(nèi)實驗的不確定性，以及目前開發(fā)出來的越來越豐富的研究手段，要想研究結(jié)果得到認同，多種方法交叉驗證也能為自己的論文質(zhì)量增加砝碼。

 

此外，Cre-LoxP動物雖然在對基因的空間特異性研究方面已經(jīng)很成熟了，也存在轉(zhuǎn)入的啟動子在多個組織中同時表達的情況，而如果這時我們的焦點僅僅是一種組織，那么其他組織中Cre的表達仍然會對我們的研究精度產(chǎn)生干擾。AAV的定點注射恰好可以完美地解決這個問題，因為我們只需要在自己想要研究的組織中注射病毒就好，區(qū)域特異性很強。

 

為了進一步利用好手頭的基因編輯鼠，AAV注射的方案也可以分為兩種，一種是如果手頭有LoxP的大鼠，可以注射AAV包裝組織特異性的Cre；反過來，如果手頭有Cre大鼠，則可以反過來注射包裝了連端有LoxP位點的目的基因或者其他元件的病毒。不過一般而言，對組織特異性Cre進行AAV包裝更為常見。

 

圖3. AAV病毒包裝DNA與大鼠聯(lián)用進行條件性表達

 

雖然AAV介導(dǎo)的條件性基因編輯有著上面所提到的諸多優(yōu)點，但凡是有利就必有其弊。AAV注射的弊端首先就在于其包裝片段長度短，這就注定一些大片段的基因無法采用這種方法，使其適用范圍受到局限，經(jīng)常需要在報告基因等附件基因元件上做出取舍，Cre基因之前啟動子的選擇也比較受限制；另外一點就是有一定的學(xué)習(xí)成本，這個成本包括時間和資金花費，尤其是腦部注射，由于要精確到不同的腦區(qū)，而老鼠的腦子本來就不大，而且由于年齡，性別，品系，生長史等原因，每只動物都并不會完全長成圖譜中的樣子，所以要精確掌握給藥位置是需要狠下一番功夫的；病毒由于是外源物，并非細胞本身產(chǎn)生，因此會出現(xiàn)注射部位的濃度分布不均，從而對實驗結(jié)果造成影響，這很好理解，注射的中心部位的病毒含量肯定是要高于周邊的。最后就是成本問題，雖然大多數(shù)情況下采用AAV進行條件性表達的成本是要低于Cre-LoxP小鼠的，但也有兩種情況例外，首先就是如果我們采用的是全身性注射，病毒的消耗量也是很大的，而且隨著注射病毒動物數(shù)量的增加，病毒的花費可以說是線性增長的；而采用雜交小鼠的方案則不同，雖然前期投入以及動物的飼養(yǎng)都是大量經(jīng)費的燃燒，但是一旦品系構(gòu)建成功，不出意外的話可以持續(xù)使用，后期的費用就是飼養(yǎng)普通動物的費用水平了，呈邊際遞減狀態(tài)。

 

總而言之，只有充分考慮兩種方法的利弊之后再進行決策才能將其運用自如，在條件允許的情況下，AAV輔助條件性敲除動物和傳統(tǒng)的Cre-LoxP動物即有互補性，又能相互驗證，在加上大鼠本身的優(yōu)點，在代謝，心血管和神經(jīng)等方面將具有無窮的潛力，為這些疾病提供更完善的模型，成為生物醫(yī)藥研究中不可或缺的助力。

 

 

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