細胞培養(yǎng)：血清與污染以外值得重視的問題-細胞老化

常有用戶提到細胞狀態(tài)不好，比如：細胞不再透亮，內(nèi)部有很多細碎的小黑點，細胞形態(tài)不規(guī)則，培養(yǎng)液變黃……
這時，除了考慮血清和細菌污染的問題，細胞老化也不容忽視~

何為細胞老化？

1882年，德國生物學(xué)家Weismann曾大膽預(yù)測“在細胞水平存在老化現(xiàn)象”。他推測：機體的壽命限制受控于體細胞的分裂能力；在遺傳進化中，不同物種的體細胞獲得了不同分裂的潛能，從而決定了不同物種的壽命長短。
20世紀50年代，Swin和他的同事利用原代細胞體外培養(yǎng)試驗證明了來源于不同物種的纖維細胞均不具備無限分裂的潛能。取得突破性進展的還是Hayflflick和Moorhead，他們做了更系統(tǒng)更細致的觀察和描述，他們對25株人成纖維細胞進行原代培養(yǎng)，在這個過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過約50次傳代之后，所有細胞出現(xiàn)功能退化，并且喪失分裂能力的現(xiàn)象。此后人們將這一現(xiàn)象稱之為“Hayflflick極限”或者自發(fā)性老化。之后也有事實證明，細胞老化并不是體外培養(yǎng)所導(dǎo)致，細胞在體內(nèi)也會隨著年齡的增長，逐步走向老化。
 

細胞老化的基本特征？

長期的細胞周期阻滯是老化細胞的基本特征，也是體外鑒定細胞老化不可或缺的指標。為了檢查細胞是否躍出了細胞周期，人們通常檢測增殖指示分子Ki-67的表達豐度；或者通過將與胸腺嘧啶相似的溴脫氧尿嘧啶（Bromodeoxyuridine，BrdU）摻入到細胞培養(yǎng)基中，觀察是否有新的DNA合成。細胞老化主要表現(xiàn)為G1期阻滯，個別情況下也可伴隨G2/M期周期阻滯，或直接由G2/M期阻滯誘發(fā)形成。
雖然由于細胞周期的中斷和DNA復(fù)制的停止，老化細胞內(nèi)的DNA含量與正常細胞類似，但 RNA與蛋白質(zhì)豐度均比正常細胞要明顯升高。這是因為，盡管細胞進入老化階段后蛋白質(zhì)的整體合成速率降低，但是蛋白質(zhì)的降解體系受到更加明顯的抑制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)持續(xù)堆積。但，由于不同組織來源的細胞，其形態(tài)本就各不相同，因此，目前還并無客觀的、統(tǒng)一的標準從細胞形態(tài)判斷并定義老化細胞。換句話說，目前并不能直接根據(jù)細胞的形態(tài)去判斷是否老化細胞。
無論是原代細胞或是細胞株，在細胞培養(yǎng)過程中細胞老化現(xiàn)象是存在且常見的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細胞會出現(xiàn)的特征包括：細胞增殖變慢、細胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細胞體積增大、細胞扁平、細胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象。
 

總結(jié)如下

• 細胞老化最開始的現(xiàn)象通常為細胞內(nèi)部會出現(xiàn)空泡（可能是凋亡小體），也可能會出現(xiàn)黑點，大多沿細胞周邊排布，內(nèi)部中間也可能會顯現(xiàn)一些，但相對周邊較少；
• 老化的細胞會出現(xiàn)細胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，胞膜起泡，皺縮等現(xiàn)象；
• 老化以后的細胞會出現(xiàn)立體感慢慢消失，開始成扁平狀，細胞與細胞之間的間隔減小或混在一起，細胞不再是梭形，而會成為各種不規(guī)則形狀；
• 細胞折光性變差，鏡下可見細胞“變薄”，做轉(zhuǎn)染實驗時，細胞死亡率會較高，但培養(yǎng)液不會發(fā)生迅速變黃的現(xiàn)象，仍清亮。（如果是細菌污染的話，一般會出現(xiàn)培養(yǎng)液的迅速變黃，混濁，鏡下可見大量繁殖的細菌；若是支原體污染的話，細胞也會失去正常形態(tài)，會有細胞的死亡）；
• 細胞的貼壁性減弱，開始有細胞漂浮在培養(yǎng)液中；
• 老化的細胞表面分泌物會增多，細胞表面的純凈度越來越低；
• 分裂的細胞數(shù)量明顯的減少，同時細胞的增殖速度也會大大下降； 
• 細胞開始長角分化。

如下圖：

▲ 圖1 HEK293細胞                                                ▲圖2 MSC細胞

圖1  實心箭頭指示的是發(fā)生細胞老化的HEK293細胞，SA-β-gal染色陽性，而空心箭頭指的是未發(fā)生老化的細胞。

圖2  被染上藍色的是發(fā)生老化的MSC細胞, 未被染色的是未發(fā)生老化的細胞。

由圖片可以看出老化細胞體積增大、細胞扁平。
 

細胞培養(yǎng)中如何預(yù)防老化？
 

• 防止細胞老化最主要還是要做到勤觀察、勤換液、勤傳代、勤保種，特別是傳代，不能等細胞太密了之后傳，一般細胞建議長到70％融合度傳代最好；
• 換培養(yǎng)液應(yīng)該根據(jù)自己細胞消耗培養(yǎng)基的情況來確定是否該換。如果感覺時間不好把握的話就多培養(yǎng)幾瓶細胞，在不同的時間換液，最后再來比較下，看什么時候換液好，得出自己的結(jié)論；
• 選擇正確的血清與培養(yǎng)基：細胞對血清特別敏感，直接影響細胞的生長。一定要選擇適合的血清不然就會因營養(yǎng)物質(zhì)不協(xié)調(diào)而導(dǎo)致細胞老化；
• 在間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)時必然要進行消化，但是消化對細胞的表面蛋白質(zhì)有很強的破壞作用，因此不能長時間進行消化并且在選擇消化酶時也要選擇較為合適的pH和濃度，不然就會使細胞老化或者分化； 
• 在開始養(yǎng)細胞并傳代時，也要特別注意凍存細胞，以保持細胞有種子庫存在，可以有效避免細胞損傷。

雖然，老化細胞不會立即死亡，但其基因表達會發(fā)生變化，如果細胞老化現(xiàn)象嚴重，建議從種子庫或工作庫重新復(fù)蘇細胞。
在進行細胞培養(yǎng)時，我們經(jīng)常會聽到一些專業(yè)名詞，原代培養(yǎng)是什么？什么是世代數(shù)？細胞系是什么？有限細胞系又代表的是什么？有的專有名詞搞不清楚的話，會對細胞培養(yǎng)過程也會有一定的影響。根據(jù)老師們的反饋，我們總結(jié)了以下容易混淆的概念供大家參考~

1、原代培養(yǎng)（Primary culture）

開始于直接取自生物體的細胞、組織或器官的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。通常代表異質(zhì)細胞群，很難標準化和繁殖。它們的壽命一般有限，而且已知它們會隨著時間而改變其差異特征。

2、傳代（Passage(Subculture)）

細胞從一個皿里轉(zhuǎn)移或傳代到另一皿里的過程稱為細胞傳代。這是一個操作行為，無法準確定義細胞分裂次數(shù)。

3、傳代次數(shù)（Passage number）

一種細胞被傳代培養(yǎng)的次數(shù)稱為傳代次數(shù)。

4、世代數(shù)（Generation number）

一種細胞所經(jīng)歷的細胞數(shù)量倍增次數(shù)稱為世代數(shù)。

5、群體倍增時間（Population doubling time）

在對數(shù)生長期中期細胞數(shù)量翻倍所需要的時間間隔稱為群體倍增時間。

6、群體倍增次數(shù)（Population doubling）

在培養(yǎng)過程中細胞所經(jīng)歷的細胞數(shù)量倍增次數(shù)稱為群體倍增次數(shù)。

7、細胞系（Cell line）

原代細胞經(jīng)過第一次傳代后增殖的細胞稱為細胞系或亞克隆。隨著細胞的傳代，生長能力最強的細胞會占據(jù)優(yōu)勢，最終導(dǎo)致細胞群體在基因型和表現(xiàn)型上達到一定程度的均一性。

8、細胞株（Cell strain）

細胞系通過選擇或克隆獲得的具有特征的細胞系稱為細胞株。與親代細胞系起始時相比，細胞株往往會獲得其他一些遺傳學(xué)改變。

9、有限細胞系（Finite cell line）

通過傳代增殖但在體外只能增殖有限細胞數(shù)量的一種細胞稱為有限細胞系（通常60-70倍增次數(shù)）。

10、衰老（Senescence）

與染色體端�？s短相聯(lián)系的生物調(diào)控的增殖潛力損失稱為細胞衰老。存活的細胞也可能保留一些功能活性。

11、永生化（Immortalization）

獲得無限的壽命，可能是細胞自發(fā)產(chǎn)生的，也可能是以轉(zhuǎn)染引起的。

12、無限細胞系（Infinite/immortal/strain）

具有無限增殖能力的細胞系或細胞株稱為無限細胞系/連續(xù)細胞系。

13、平板效率（Plating efficiency）

在傳代培養(yǎng)中產(chǎn)生集落的細胞的百分比稱為平板效率。如果每個集落都可以說是來自一個細胞，那么平板效率等同于克隆效率/集落形成效率。有時，平板效率被粗略地用來描述傳代培養(yǎng)后存活的細胞數(shù)量，但這被更好地稱為種子效率。

Reference：

1. Zhang Ju，Liu Siqi，Xu Ningzhi. General Features and Current Progress on the Research. Chinese Journal of Cell Biological 2013，35(1)：1-16.
2. Gavrilov LA，Gavrilova NS. The Biology of Life Span: A Quanti tative Approach New York: Harwood Academic Pubilshers, 1991.
3. Swim HE, Parker RF. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hygiene 1957; 66(2): 235-43.
4.  Martin GM, Sprague CA, Epstein CJ. Replicative life-span of cultivates human cells: Effects of donors’s age, tissue, and genotype. Lab Invest 1970; 23(1): 86-92.
5. Hayflick L. Biomedical gerontology: Current theories of biological aging. Gerontologist 1974; 14(5 pt 1): 454,458.
6. Dice JF. Altered intracellular protein degradation in aging: A possible cause of proliferative arrest. Exp Gerontol 1989; 24(5/6): 451-9.
    

   

   BI中國市場部：上海逍鵬生物科技有限公司
   產(chǎn)品咨詢：021-58785545-8006, 18917190011
   技術(shù)支持：400-820-3979

   了解詳細信息可戳原文，轉(zhuǎn)載請標明出處
   詳情點擊：閱讀原文