二氧化碳培養(yǎng)箱操作詳解與實(shí)驗(yàn)中的多種應(yīng)用

3分鐘認(rèn)識二氧化碳培養(yǎng)箱

 

01 什么是二氧化碳培養(yǎng)箱

二氧化碳培養(yǎng)箱是通過在培養(yǎng)箱箱體內(nèi)模擬形成一個類似細(xì)胞/組織在生物體內(nèi)的生長環(huán)境，用來對細(xì)胞/組織進(jìn)行體外培養(yǎng)的一種裝置。

二氧化碳培養(yǎng)箱比普通的電熱恒溫培養(yǎng)箱多了二氧化碳濃度控制系統(tǒng)，并對箱內(nèi)環(huán)境的溫度和濕度進(jìn)行了嚴(yán)格控制，如穩(wěn)定的CO₂水平（5％）、穩(wěn)定的溫度（37℃）、較高的相對濕度（95％），因此使生物細(xì)胞，組織等的培養(yǎng)成功率、效率都得到改善，是普通的電熱恒溫培養(yǎng)箱無法替代的新型培養(yǎng)箱。

 

02 為什么要使用二氧化碳培養(yǎng)箱

氣體是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán),產(chǎn)生供給細(xì)胞生長增殖的能量和合成細(xì)胞生長所需用的各種成分。開放培養(yǎng)時一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。CO₂既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)液的pH有直接關(guān)系。動物細(xì)胞多數(shù)需要微堿性環(huán)境，pH為7.2~7.4，以不超出6.8~7.6為宜。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，隨著CO₂釋放量的增多，培養(yǎng)基會變酸，因此常在培養(yǎng)基中加入NaHCO₃（與CO₂溶于水后所形成的H₂CO₃構(gòu)成一個緩沖對）來調(diào)節(jié)pH。NaHCO₃具有釋放CO₂的傾向，加入CO₂可以抑制這個反應(yīng)的進(jìn)行。培養(yǎng)箱中CO₂濃度應(yīng)與培養(yǎng)液中NaHCO₃濃度相平衡，如果培養(yǎng)箱中CO₂濃度設(shè)定在5%，培養(yǎng)液中NaHCO₃的加入量應(yīng)為1.97 g/L；如果CO₂濃度維持在10%，則NaHCO₃的加入量應(yīng)為3.95 g/L。

精確控制二氧化碳濃度，這就是二氧化碳培養(yǎng)箱成為細(xì)胞或組織體外培養(yǎng)環(huán)境不二之選的重要原因。

 

03 如何實(shí)現(xiàn)CO₂濃度精確控制

二氧化碳培養(yǎng)箱常用熱導(dǎo)（TC）傳感器或紅外（IR）傳感器檢測箱體內(nèi)二氧化碳濃度的變化。當(dāng)二氧化碳培養(yǎng)箱的門被打開時，CO₂從箱體內(nèi)漏出，此時傳感器就會探測到CO₂濃度的降低，并做出及時的反應(yīng)，重新注入CO₂使其恢復(fù)到原先預(yù)設(shè)的水平。

（1）熱導(dǎo)（TC）傳感器

熱傳導(dǎo)傳感器(TC)監(jiān)控CO₂濃度的工作原理是通過測量兩個電熱調(diào)節(jié)器之間的電阻變化來實(shí)現(xiàn)的。箱內(nèi)CO₂濃度的變化會改變兩個電熱調(diào)節(jié)器間的電阻，輸入CO₂氣體的低熱導(dǎo)率會使腔內(nèi)空氣的熱導(dǎo)率發(fā)生變化，這樣就會產(chǎn)生一個與CO₂濃度直接成正比的電信號。從而促使傳感器產(chǎn)生反應(yīng)以達(dá)到調(diào)節(jié)CO₂水平的作用。

TC控制系統(tǒng)存在一定的缺點(diǎn)：①TC控制系統(tǒng)檢測結(jié)果會產(chǎn)生漂移；②重新校準(zhǔn)的周期較長；③箱內(nèi)溫度和相對濕度的改變會影響傳感器的精確度。當(dāng)箱門被頻繁打開時，不僅CO₂濃度，溫度和相對濕度也會發(fā)生很大的波動，因而影響了TC傳感器的精度。當(dāng)需要精確的培養(yǎng)條件和頻繁開啟培養(yǎng)箱門時，此控制系統(tǒng)就顯得不太適用了。

（2）紅外（IR）傳感器

紅外傳感器（IR）系統(tǒng)包括一個紅外發(fā)射器和一個接收檢測器，當(dāng)箱體內(nèi)的CO₂吸收了發(fā)射器發(fā)射的部分紅外線之后，接收檢測器就可以檢測出紅外線的減少量，而被吸收紅外線的量正好對應(yīng)于箱體內(nèi)CO₂的水平，從而可以得出箱體內(nèi)CO₂的濃度。IR系統(tǒng)相比TC系統(tǒng)，穩(wěn)定性更高，檢測結(jié)果無漂移，重新校準(zhǔn)更快，因而價格也會有所上升。當(dāng)前市場上出售的二氧化碳培養(yǎng)箱常規(guī)配置的是TC系統(tǒng)，當(dāng)然也有一些生產(chǎn)制造商更為注重CO₂的濃度精確控制，出廠的二氧化碳培養(yǎng)箱均標(biāo)配IR系統(tǒng)，Esco則選用的是該系統(tǒng)。

 

但也并不是的CO₂濃度紅外傳感器的工作原理都是一樣的，基于非發(fā)散性紅外線氣體檢測原理的測量方法主要有3種：單光束單波長測量、雙光束雙波長測量和單光束雙波長測量。

單光束單波長測量，顧名思義，這種CO₂傳感器只能提供單一波長的光線，由于其穩(wěn)定性極易受到諸如燈泡老化、灰塵污染、溫度變化及光線發(fā)射特性變化等因素的影響，因而其測量的穩(wěn)定性和精度都不夠準(zhǔn)確。

雙光束雙波長測量，這種測量儀器備有2個光波通道，1個探測器和2個濾光鏡，與單光束單波長測的儀器比較，其精度和穩(wěn)定性都有所提高，但在實(shí)際應(yīng)用中，2個光波通道受到的影響程度同樣也會給這類測量儀器帶來因非對稱影響而精度失準(zhǔn)的問題。

單光束雙波長測量，保證了二氧化碳濃度控制的高精度性，避免了雙光束衰減干擾不同步引起的誤差，也避免了單光束單波長探頭的不穩(wěn)定性，保護(hù)培養(yǎng)材料。Esco直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱采用的就是芬蘭維薩拉單光束雙波長IR傳感器。

三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱則在二氧化碳培養(yǎng)箱的基礎(chǔ)上增加了氧氣濃度控制系統(tǒng)。

 

04 如何實(shí)現(xiàn)溫度精準(zhǔn)控制

維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長,必須有恒定而適宜的溫度。不同種類的細(xì)胞對培養(yǎng)溫度要求也不同，例如魚、昆蟲和兩棲類細(xì)胞的適宜培養(yǎng)溫度是25-28℃，哺乳動物細(xì)胞的適宜培養(yǎng)溫度是35-37℃，發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則適合在高于40℃的條件下生長。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.5℃±0.5℃,偏離這一溫度范圍,細(xì)胞的正常代謝會受到影響,甚至死亡。保持培養(yǎng)箱內(nèi)恒定的溫度是維持細(xì)胞健康生長重要因素。CO₂培養(yǎng)箱通過電熱絲加熱, 主要有水套式加熱和氣套式加熱兩種系統(tǒng)。

（1）水套式加熱

水套式加熱通過一個獨(dú)立的水套層包圍內(nèi)部的箱體來維持溫度恒定，其優(yōu)點(diǎn)：水是一種很好的絕熱物質(zhì)，斷電情況下，水套式系統(tǒng)可以在較長時間內(nèi)保持培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，適于實(shí)驗(yàn)環(huán)境不太穩(wěn)定（如有用電限制或經(jīng)常停電）的用戶選用。

（2）氣套式加熱

 

氣套式加熱是通過遍布箱體氣套層內(nèi)的加熱器直接對內(nèi)箱體進(jìn)行加熱，又叫六面直接加熱。氣套式與水套式相比，具有加熱快、溫度恢復(fù)迅速的特點(diǎn)，有利于短期培養(yǎng)以及需要箱門頻繁開關(guān)取放樣的培養(yǎng)。此外，對于使用者來說氣套式設(shè)計比水套式更簡單化（水套式需要對水箱進(jìn)行加水、清空和清洗，并要經(jīng)常監(jiān)控水箱運(yùn)作的情況，還有潛在的污染隱患）。

氣套式加熱優(yōu)點(diǎn)總結(jié)：①重量更輕、運(yùn)輸或搬運(yùn)更方便；②加熱快，溫度的恢復(fù)比水套式培養(yǎng)箱迅速，特別有利于短期培養(yǎng)以及需要箱門頻繁開關(guān)取放樣的培養(yǎng)；③不會發(fā)生因?yàn)槁┧�造成樣品污染；④可選擇更多滅菌方式（水套利用水作為傳熱介質(zhì)，高溫加熱滅菌困難）。

為了滿足低溫培養(yǎng)的需求，Esco CelCulture系列內(nèi)置制冷系統(tǒng)二氧化碳培養(yǎng)箱可供用戶選擇，允許在高/低于室溫的溫度下進(jìn)行研究。

 

05 如何滿足細(xì)胞培養(yǎng)的濕度要求

水是細(xì)胞的重要組成部分，在培養(yǎng)箱中對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)過程里，制冷或者制熱最直接的影響是細(xì)胞的培養(yǎng)基快速蒸發(fā)失水，蒸發(fā)將導(dǎo)致培養(yǎng)基上的滲透作用增強(qiáng)，產(chǎn)生滲透性脫水；培養(yǎng)基中鹽濃度增加，細(xì)胞中水分跑出細(xì)胞外細(xì)胞收縮，新陳代謝變緩，細(xì)胞死亡。

培養(yǎng)箱內(nèi)相對濕度的控制室非常重要的，飽和濕度環(huán)境可以避免培養(yǎng)液中二氧化碳逃逸，保持pH值穩(wěn)定，也能防止由于干燥使培養(yǎng)液中水分蒸發(fā)，滲透壓升高，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)失敗。大多數(shù)的二氧化碳培養(yǎng)箱是通過增濕盤的蒸發(fā)作用產(chǎn)生濕氣的，大型的二氧化碳培養(yǎng)箱是用蒸汽發(fā)生器或噴霧器來控制相對濕度水平的。一些培養(yǎng)箱在底部設(shè)置濕度蓄水池，這樣可以增強(qiáng)蒸發(fā)作用，但是，這個系統(tǒng)也更復(fù)雜，由于復(fù)雜結(jié)構(gòu)的增加一些難以預(yù)料的問題也會在使用過程中出現(xiàn)。

 

06 如何有效控制污染物

體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功與否的首要條件，因而需要操作過程中盡可能地保證無菌。二氧化碳培養(yǎng)箱可應(yīng)用不同的裝置去減少和防止污染的發(fā)生，讓用戶具有多重滅菌選擇。

（1）干熱滅菌

利用干熱空氣使細(xì)菌的原生質(zhì)凝固，并使細(xì)菌的酶系統(tǒng)破壞而殺死細(xì)菌的方法。對于耐熱芽孢桿菌，干熱滅菌容易形成芽孢，無法一次徹底滅菌。通常需要在37℃培養(yǎng)，使芽孢復(fù)蘇后進(jìn)行二次滅菌才能達(dá)到徹底滅菌效果。

（2）濕熱滅菌

以高溫高壓水蒸氣為介質(zhì)，由于蒸汽潛熱大，穿透力強(qiáng)，容易使蛋白質(zhì)變性或凝固，進(jìn)而導(dǎo)致微生物的死亡，所以該法的滅菌效率比干熱滅菌法高。且濕熱滅菌溫度較干熱低，對電子元件特別是傳感器的損傷小，可以延長培養(yǎng)箱的使用壽命。

（3）紫外滅菌

紫外線滅菌是用紫外線管照射進(jìn)行的。波長在220-300nm的紫外線稱為“殺生命區(qū)”，紫外線殺菌效果取決于紫外線燈管的功率大小和照射時間，加上被照空間及面積大小等諸多不穩(wěn)定因素，導(dǎo)致紫外線殺菌效果不是很理想。此外紫外線對人體有傷害作用。

（4）過濾滅菌

進(jìn)入培養(yǎng)箱的氣體均經(jīng)過0.2μm在線過濾器過濾，以消除氣體雜質(zhì)和污染物。

Esco 二氧化碳培養(yǎng)箱配置ULPA超高效濾器，可持續(xù)保持樣品腔內(nèi)空氣潔凈度達(dá)到ISO 5級水晶，有效去除實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和樣品腔內(nèi)空氣中的污染物，保證潔凈的氣流循環(huán)。

（5）全銅內(nèi)膽抗菌

長久以來，銅的抗菌性能得到了全球公認(rèn)并被廣泛使用。Esco CelCulture全銅內(nèi)膽培養(yǎng)箱，100%全銅內(nèi)膽能夠?qū)φ滟F樣品提供額外的保護(hù)。

（6）抗菌涂層抑菌

外部選用抑菌材料主要成份含有銀離子，具有長期抑菌作用，且不會因?yàn)楸砻媲逑炊�被消除。Esco Isocide表面抗菌涂層技術(shù)可有效抑制微生物在箱體表面滋生，實(shí)驗(yàn)證明，可在24小時內(nèi)抑制箱體表面99.9%的細(xì)菌滋生。

體會。

07 如何便捷有效地控制二氧化碳培養(yǎng)箱

微處理控制系統(tǒng)主要包適高溫自動調(diào)節(jié)和跟蹤警報裝置、CO₂警報裝置、密碼保護(hù)設(shè)置、自動校準(zhǔn)系統(tǒng)等，有些配置了高效過濾器的二氧化碳培養(yǎng)箱還設(shè)有過濾器更換報警裝置。實(shí)現(xiàn)參數(shù)設(shè)定、故障排查和分級菜單進(jìn)入一體化操作；儀器安全狀態(tài)可清晰顯示，溫度和CO₂濃度輕松實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)控；特制的聲、光報警提示功能及時提醒用戶發(fā)現(xiàn)和處理問題。

Esco二氧化碳培養(yǎng)箱設(shè)置了特定的智能化數(shù)據(jù)和事件檢測器記錄裝置，智能化記錄培養(yǎng)箱使用過程中運(yùn)行參數(shù)，并可以在LCD顯示屏上通過程序軟件調(diào)取記錄的數(shù)據(jù)，內(nèi)置的16M閃存保證了運(yùn)行數(shù)據(jù)的長期儲存。還有Esco Voyager軟件包，使用Esco總線通訊協(xié)議通過RS485與Esco二氧化碳培養(yǎng)箱連接，可實(shí)現(xiàn)設(shè)備的遠(yuǎn)程監(jiān)控、數(shù)據(jù)記錄和編程。同一臺電腦可以連接多達(dá)18臺裝置設(shè)備，并以用戶設(shè)定的時間間隔自動發(fā)送記錄數(shù)據(jù)的電子郵件，為用戶的珍貴樣本提供多一層保護(hù)。

 

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