Western Blot實(shí)驗(yàn)操作中的縮短數(shù)據(jù)差異的應(yīng)對(duì)方法

做Western Blot的小伙伴，你是不是還在那里熬夜趕實(shí)驗(yàn)？是不是還在糾結(jié)今天的結(jié)果怎么和昨天的差異這么大？是不是在為選擇哪種檢測(cè)方法而煩惱？在為實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性而抓狂？今天小編就和大家聊一下Western Blot中遇到的問(wèn)題以及應(yīng)對(duì)方法。

歸一化問(wèn)題：

做Western Blot經(jīng)常需要對(duì)蛋白進(jìn)行歸一化，經(jīng)典的歸一化方法是看家蛋白歸一化，看家蛋白需要選擇在不同樣品間穩(wěn)定表達(dá)的蛋白；其次表達(dá)豐度也需要篩選，如果豐度過(guò)高，目的蛋白豐度與看家蛋白差異過(guò)大，那兩者檢測(cè)定量時(shí)就不在一個(gè)線性范圍。這樣的篩選過(guò)程非常耗時(shí)耗力。即使篩選到合適的看家蛋白，對(duì)其歸一化的過(guò)程也需要多次重復(fù)調(diào)節(jié)才可以。

檢測(cè)靈敏度問(wèn)題：

小編做Western Blot檢測(cè)時(shí)，由于目的蛋白含量低經(jīng)常曝光不出來(lái)，同時(shí)老儀器檢測(cè)靈敏度不夠高，只能不斷調(diào)整實(shí)驗(yàn)，提高上樣量，再反復(fù)進(jìn)行摸索，做Western 做到懷疑人生。

蛋白定量重復(fù)性問(wèn)題：

Western Blot檢測(cè)時(shí)，化學(xué)發(fā)光依賴酶活性和底物濃度，發(fā)光信號(hào)不穩(wěn)定，因此定量時(shí)容易出現(xiàn)誤差，重復(fù)性相對(duì)較差，也只能不斷實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行調(diào)整和驗(yàn)證。

多個(gè)目的蛋白檢測(cè)問(wèn)題：

Western Blot檢測(cè)時(shí)，有時(shí)需要對(duì)多個(gè)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，這時(shí)的實(shí)驗(yàn)就會(huì)變的繁瑣，需要對(duì)每一個(gè)蛋白進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，剪膜，剝離膜經(jīng)常要做，但是經(jīng)過(guò)這些步驟又會(huì)影響定量的精準(zhǔn)性，小編也很為難。

那么上述問(wèn)題有沒(méi)有好的解決方法呢？這里悄悄告訴大家一個(gè)好消息，采用Sapphire雙模式多光譜成像系統(tǒng)，可以很好的解決上述困擾，好文章也在向你招手。

Sapphire成像系統(tǒng)采用雙模式，既有掃描式又有CCD成像式；多達(dá)四激光激發(fā)用于熒光成像，每個(gè)通道配有自己獨(dú)立的檢測(cè)器，PMT檢測(cè)器用于藍(lán)光成像，3個(gè)APD檢測(cè)分別用于綠光、紅光和近紅外檢測(cè)，高分辨率CCD用于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，在全光譜范圍內(nèi)避免信號(hào)損失；動(dòng)態(tài)范圍可達(dá)6log；軟件操作簡(jiǎn)單，易于上手。

應(yīng)對(duì)均一化問(wèn)題，已有眾多期刊建議采用總蛋白均一化，總蛋白均一化能夠更加真實(shí)的反應(yīng)目的蛋白表達(dá)量的變化，同時(shí)也無(wú)需繁瑣的篩選看家蛋白、調(diào)整蛋白上樣，只需對(duì)總蛋白進(jìn)行染色和調(diào)整，Azure提供總蛋白歸一化試劑和相應(yīng)的AzureSpot分析軟件，輕松搞定蛋白均一化問(wèn)題 。

應(yīng)對(duì)低豐度蛋白檢測(cè)問(wèn)題，Sapphire雙模式多光譜成像系統(tǒng)可以加配610萬(wàn)像素，大光圈的優(yōu)質(zhì)CCD檢測(cè)器，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到fg級(jí)，動(dòng)態(tài)范圍是傳統(tǒng)膠片的4倍。可以進(jìn)行累積曝光，可以快速得到你需要的圖像，無(wú)需多次重復(fù)和改變上樣。

應(yīng)對(duì)重復(fù)性問(wèn)題，熒光檢測(cè)方法與傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光不同，熒光檢測(cè)方法不依賴酶活性和底物，二抗標(biāo)記熒光基團(tuán)，信號(hào)強(qiáng)度和上樣量成線性關(guān)系，信號(hào)持久，可以得到更好的重復(fù)性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)可以快速完成。

應(yīng)對(duì)多種蛋白檢測(cè)問(wèn)題，熒光檢測(cè)的一個(gè)好處是，無(wú)需剝離和重孵育，即可在一張印跡膜上進(jìn)行多種蛋白的檢測(cè)，減少蛋白變化的誤差，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量。

Azure Sapphire雙模式成像系統(tǒng)

無(wú)需再為Western實(shí)驗(yàn)所累